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文獻(xiàn)分享
Real-time recombinase-aided amplifcation assay for rapid amplifcation of the IS1081 gene of Mycobacterium tuberculosisYuanyuan Liu,Weicong Ren,Zhongtan Xue,Yuedong Miao,Wei Wang,Xuxia Zhang,Cong Yao,Yuanyuan Shang,Shanshan Li,Fengling Mi, Yu PangReceived: 24 February 2023 / Accepted: 23 May 2023
01 背景
結(jié)核病是世界上最緊迫的公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)2022年世界衛(wèi)生組織（WHO）全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2021年全球約1060萬例新發(fā)結(jié)核病患者，死亡160萬例，而結(jié)核病的確診率卻只有63%。目前結(jié)核病確診手段耗時(shí)長(zhǎng)，診斷延誤會(huì)增加傳播的機(jī)會(huì)。因此，開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法尤為重要。
首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院副書記龐宇老師課題組在《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 》期刊上發(fā)表文章《Real-time recombinase-aided amplifcation assay for rapid amplifcation of the IS1081 gene of Mycobacterium tuberculosis》，影響因子4.5。
課題組開發(fā)了一種新的基于MIRA的分子檢測(cè)方法，從臨床標(biāo)本中鑒定結(jié)核桿菌。依據(jù)文中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)核病患者的臨床診斷中，MIRA技術(shù)檢測(cè)相對(duì)于qPCR的敏感性甚至有一定優(yōu)勢(shì)。
02 研究方法
課題組使用含有H37RvfullengthIS1081基因的重組質(zhì)pEASY-Blunt-IS1081進(jìn)行連續(xù)稀釋分析，檢測(cè)限為163個(gè)拷貝/反應(yīng)。與傳統(tǒng)qPCR相比，MTB的檢測(cè)靈敏度提高了約1.5倍。
且在11個(gè)非結(jié)核分枝桿菌和其他臨床細(xì)菌的特異性實(shí)驗(yàn)中，MIRA技術(shù)的特異性表現(xiàn)優(yōu)秀
03 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
靈敏度
采用含有IS1081基因全長(zhǎng)的連續(xù)稀釋重組質(zhì)粒，測(cè)定實(shí)時(shí)MIRA檢測(cè)MTB的靈敏度，并與qPCR進(jìn)行比較。如上圖a和c所示，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)限均為每反應(yīng)100拷貝。并做了Probit回歸分析，MIRA技術(shù)檢測(cè)在95%概率下的擴(kuò)增限為163拷貝，而qPCR的擴(kuò)增限為244拷貝。
特異性
分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、異種分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、海洋分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、豬分枝桿菌等陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果只有結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)陽性，見上圖曲線16。
臨床樣本測(cè)試
為了驗(yàn)證實(shí)時(shí)MIRA的方法的臨床性能，課題組檢測(cè)了173份臨床痰標(biāo)本,臨床樣本分為5組：高、中、低、極低和陰性。以Xpert為金標(biāo)準(zhǔn)，MIRA的檢出率為72.5%，明顯高于qPCR的53.8%。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
除了具有良好的診斷準(zhǔn)確性外，MIRA技術(shù)對(duì)結(jié)核病患者的臨床診斷具有多種優(yōu)勢(shì)：
? MIRA技術(shù)和qPCR 有著同等的靈敏度和特異性。
?檢測(cè)可以在15-30 min內(nèi)完成，優(yōu)于qPCR（120 min）和LAMP（40 min），從而在結(jié)核病中提供了一種潛在的替代POCT。
? 采用42°C的恒溫溫度擴(kuò)增標(biāo)本模板DNA。除了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)外，在480 nm燈下，肉眼也可以檢測(cè)到擴(kuò)增子。
?MIRA技術(shù)不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和熟練的實(shí)驗(yàn)人員，這更適合在資源有限的環(huán)境中擴(kuò)大規(guī)模。
?相比于qPCR，MIRA試劑檢測(cè)的成本較低，可成為結(jié)核病流行國(guó)家常規(guī)使用的方法。