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CRISPR診斷技術(shù)在水稻干線蟲快檢中的應(yīng)用

水稻干尖線蟲又稱貝西滑刃線蟲 (Aphelenchoides besseyi),是水稻白尖病的致病因子,該線蟲通過種子進行傳播,寄生于種子中在干燥的條件下可存活3年。其所引起的水稻干尖線蟲病廣泛發(fā)生在世界各國水稻產(chǎn)區(qū),嚴重感染可造成50%的產(chǎn)量損失。同時,水稻干尖線蟲寄主范圍廣泛,除水稻外還可以寄生35個屬200多種植物,且該線蟲還可以取食多種真菌,被列為全球危害最為嚴重的十大植物寄生線蟲之一。因此,快速、高特異性、準確地檢測水稻種子中的水稻干尖線蟲是監(jiān)測、預(yù)防和控制水稻白尖病的重要手段。針對于此,上海市農(nóng)科院作物育種栽培研究所農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室曹黎明團隊等[1]開發(fā)了一種新穎的RPA-Cas12a-Ab方法來檢測水稻干尖線蟲,研究中所使用的Cas12/13試紙條購自南京沃博生物科技有限公司,Cas12a購自吐露港生物科技有限公司。

 

01:建立RPA-Cas12a-Ab檢測體系

該方法的技術(shù)路線是將CRISPR/Cas12a與RPA技術(shù)相結(jié)合,具體來說,首先37℃下進行20分鐘水稻干尖線蟲核酸的RPA擴增,隨后擴增產(chǎn)物進行20分鐘 CRISPR/Cas12a反應(yīng)即可通過熒光分析儀讀取結(jié)果。為了方便現(xiàn)場檢測,可采用側(cè)流層析試紙條進行讀取,耗時約5分鐘(圖1)。使用熒光分析儀時,該體系的LOD可達到1 copy/μL含目標(biāo)片段的質(zhì)粒;結(jié)合側(cè)流層析試紙條檢測,該體系的LOD可達到1000 copies/μL含目標(biāo)片段的質(zhì)粒。

 

1.RPA-Cas12a-Ab檢測示意圖

對于水稻干尖線蟲的核酸提取,作者采用的是改進的貝爾曼漏斗法。而后對提取的核酸進行RPA擴增。為達到檢測性能最佳,首先對RPA引物進行評估,在25°C、28°C、32°C、35°C、37°C、39°C、42°C和45°C不同溫度下對含有線蟲目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒進行擴增,所有溫度下均能擴增,但為了方便實驗操作和對降低設(shè)備的要求,后續(xù)RPA反應(yīng)選擇37°C,該溫度也有利于Cas12a活性的發(fā)揮(圖2)。

2.不同溫度下的RPA擴增

緊接著,作者選用ToloBio提供的的LbCas12a(#32108-03,Tolo Biotech, Anhui, China),利用該酶的反式切割活性建立了CRISPR檢測體系。crRNA是影響Cas12a反式切割活性的主要因素,所以作者針對水稻干尖線蟲目標(biāo)片段設(shè)計了8條crRNA進行crRNA的篩選,最終選擇高活性的crRNA5用于后續(xù)檢測,該crRNA5可在20分鐘時間內(nèi)獲得理想的結(jié)果(圖3)。

 

                                                                              圖3.不同crRNA的篩選

02RPA-Cas12a-Ab檢測體系的性能測試

初步建立 RPA-Cas12a-Ab檢測體系后,研究者們測試了該體系的特異性。結(jié)果表明,RPA-Cas12a-Ab檢測體系對2例水稻干尖線蟲樣本(AB1、AB2)和含水稻干尖線蟲目標(biāo)片段的質(zhì)粒檢測呈陽性;而對3例非水稻干尖線蟲樣本(AF、AS、MI),以及水稻葉片基因組樣本(Rice Leaf)均無擴增,也無CRISPR檢切信號,結(jié)果為陰性。證明了RPA-Cas12a-Ab檢測方法的特異性(圖4)。

 

4. RPA-Cas12a-Ab特異性驗證

 

作者使用含有水稻干尖線蟲目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒pUC57-18S對RPA-Cas12a-Ab檢測體系的靈敏度進行了測試,同步對比PCR與qPCR檢測方法。PCR和qPCR的LOD分別為為103101 copies/μL,而RPA-Cas12a-Ab測定的LOD達到了1 copy/μL,證明了RPA-Cas12a-Ab測定在水稻干尖線蟲檢測中比PCR和qPCR方法更靈敏。使用提取的水稻干尖線蟲的基因組DNA進行10倍梯度稀釋后,RPA-Cas12a-Ab可成功檢出10-7稀釋的基因組DNA樣本(圖5)。

 

5. RPA-Cas12a-Ab靈敏度測試

 

 

03RPA-Cas12a-Ab結(jié)合試紙條用于現(xiàn)場快速檢測

為便于現(xiàn)場檢測及方便用戶,作者將RPA-Cas12a與LFA技術(shù)相結(jié)合,建立了RPA-Cas12a-Ab-LFA檢測方案。同樣地,作者對此簡易化檢測系統(tǒng)進行了特異性和靈敏度的驗證。水稻干尖線蟲樣品(AB1和AB2)顯示出與陽性對照相似的清晰條帶,非水稻干尖線蟲樣品(AF,AS和MI)未觀察到交叉反應(yīng),這也證明了RPA-Cas12a-Ab-LFA檢測體系的特異性。使用含有水稻干尖線蟲目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒pUC57-18S和提取的水稻干尖線蟲的基因組DNA進行10倍梯度稀液后測試靈敏度,結(jié)果表明,該系統(tǒng)可檢測到1000 copies/μL的含目標(biāo)片段質(zhì)粒樣本,或是10-1稀釋的水稻干尖線蟲基因組DNA提取樣本(圖6)。

 

6.RPA-Cas12a-Ab-LFA特異性、靈敏度驗證總結(jié)


總結(jié)

總的來說,作者開發(fā)了一種新穎的RPA-Cas12a-Ab(-LFA)檢測方法,不依賴于復(fù)雜的設(shè)備和熟練的操作人員,RPA擴增和CRISPR/Cas12a反應(yīng)均可在37℃下完成,僅需一臺熒光分析儀或試紙條即可完成快速檢測,可在45分鐘內(nèi)獲得高靈敏、高特異性的檢測結(jié)果。此開發(fā)思路可廣泛應(yīng)用于其它作物感染疾病或不同病原體的檢測。

相關(guān)產(chǎn)品

Cas酶系列:

品牌

貨號

包裝規(guī)格

產(chǎn)品名稱

ToloBio

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

ToloBio

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

ToloBio

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

ToloBio

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

ToloBio

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

ToloBio

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

ToloBio

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

ToloBio

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

ToloBio

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

ToloBio

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

ToloBio

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

ToloBio

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

ToloBio

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

ToloBio

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

ToloBio

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

ToloBio

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

 恒溫擴增試劑盒及試紙條系列:

貨號

產(chǎn)品

規(guī)格

JY0209

雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0307

Tiosbio? CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條(變色龍)

50T

WLB8201KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLE8202KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLN8203KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLRB8204KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLRE8205KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLRN8206KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLB5001

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLN5002

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLR5003

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

WLRB5001

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLRN5002

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLRE5003

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

 

參考文獻:

[1].Zhang A, Sun B, Zhang J, et al. CRISPR/Cas12a Coupled With Recombinase Polymerase Amplification for Sensitive and Specific Detection of Aphelenchoides besseyi[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10: 912959.

 

 

 

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