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水稻干尖線蟲又稱貝西滑刃線蟲 (Aphelenchoides besseyi)，是水稻白尖病的致病因子，該線蟲通過種子進(jìn)行傳播，寄生于種子中在干燥的條件下可存活3年。其所引起的水稻干尖線蟲病廣泛發(fā)生在世界各國水稻產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重感染可造成50%的產(chǎn)量損失。同時，水稻干尖線蟲寄主范圍廣泛，除水稻外還可以寄生35個屬200多種植物，且該線蟲還可以取食多種真菌，被列為全球危害最為嚴(yán)重的十大植物寄生線蟲之一。因此，快速、高特異性、準(zhǔn)確地檢測水稻種子中的水稻干尖線蟲是監(jiān)測、預(yù)防和控制水稻白尖病的重要手段。針對于此，上海市農(nóng)科院作物育種栽培研究所農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室曹黎明團隊等[1]開發(fā)了一種新穎的RPA-Cas12a-Ab方法來檢測水稻干尖線蟲，研究中所使用的Cas12/13試紙條購自南京沃博生物科技有限公司，Cas12a購自吐露港生物科技有限公司。

01：建立RPA-Cas12a-Ab檢測體系

該方法的技術(shù)路線是將CRISPR/Cas12a與RPA技術(shù)相結(jié)合，具體來說，首先37℃下進(jìn)行20分鐘水稻干尖線蟲核酸的RPA擴增，隨后擴增產(chǎn)物進(jìn)行20分鐘 CRISPR/Cas12a反應(yīng)即可通過熒光分析儀讀取結(jié)果。為了方便現(xiàn)場檢測，可采用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行讀取，耗時約5分鐘（圖1）。使用熒光分析儀時，該體系的LOD可達(dá)到1 copy/μL含目標(biāo)片段的質(zhì)粒；結(jié)合側(cè)流層析試紙條檢測，該體系的LOD可達(dá)到1000 copies/μL含目標(biāo)片段的質(zhì)粒。

圖1.RPA-Cas12a-Ab檢測示意圖

對于水稻干尖線蟲的核酸提取，作者采用的是改進(jìn)的貝爾曼漏斗法。而后對提取的核酸進(jìn)行RPA擴增。為達(dá)到檢測性能最佳，首先對RPA引物進(jìn)行評估，在25°C、28°C、32°C、35°C、37°C、39°C、42°C和45°C不同溫度下對含有線蟲目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴增，所有溫度下均能擴增，但為了方便實驗操作和對降低設(shè)備的要求，后續(xù)RPA反應(yīng)選擇37°C，該溫度也有利于Cas12a活性的發(fā)揮（圖2）。

圖2.不同溫度下的RPA擴增

緊接著，作者選用ToloBio提供的的LbCas12a（#32108-03，Tolo Biotech, Anhui, China），利用該酶的反式切割活性建立了CRISPR檢測體系。crRNA是影響Cas12a反式切割活性的主要因素，所以作者針對水稻干尖線蟲目標(biāo)片段設(shè)計了8條crRNA進(jìn)行crRNA的篩選，最終選擇高活性的crRNA5用于后續(xù)檢測，該crRNA5可在20分鐘時間內(nèi)獲得理想的結(jié)果（圖3）。

                                                                              圖3.不同crRNA的篩選

02：RPA-Cas12a-Ab檢測體系的性能測試

初步建立 RPA-Cas12a-Ab檢測體系后，研究者們測試了該體系的特異性。結(jié)果表明，RPA-Cas12a-Ab檢測體系對2例水稻干尖線蟲樣本（AB1、AB2）和含水稻干尖線蟲目標(biāo)片段的質(zhì)粒檢測呈陽性；而對3例非水稻干尖線蟲樣本（AF、AS、MI），以及水稻葉片基因組樣本（Rice Leaf）均無擴增，也無CRISPR檢切信號，結(jié)果為陰性。證明了RPA-Cas12a-Ab檢測方法的特異性（圖4）。

圖4. RPA-Cas12a-Ab特異性驗證

作者使用含有水稻干尖線蟲目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒pUC57-18S對RPA-Cas12a-Ab檢測體系的靈敏度進(jìn)行了測試，同步對比PCR與qPCR檢測方法。PCR和qPCR的LOD分別為為10³和10¹ copies/μL，而RPA-Cas12a-Ab測定的LOD達(dá)到了1 copy/μL，證明了RPA-Cas12a-Ab測定在水稻干尖線蟲檢測中比PCR和qPCR方法更靈敏。使用提取的水稻干尖線蟲的基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，RPA-Cas12a-Ab可成功檢出10^-7稀釋的基因組DNA樣本（圖5）。

圖5. RPA-Cas12a-Ab靈敏度測試

03：RPA-Cas12a-Ab結(jié)合試紙條用于現(xiàn)場快速檢測

為便于現(xiàn)場檢測及方便用戶，作者將RPA-Cas12a與LFA技術(shù)相結(jié)合，建立了RPA-Cas12a-Ab-LFA檢測方案。同樣地，作者對此簡易化檢測系統(tǒng)進(jìn)行了特異性和靈敏度的驗證。水稻干尖線蟲樣品（AB1和AB2）顯示出與陽性對照相似的清晰條帶，非水稻干尖線蟲樣品（AF，AS和MI）未觀察到交叉反應(yīng)，這也證明了RPA-Cas12a-Ab-LFA檢測體系的特異性。使用含有水稻干尖線蟲目標(biāo)片段的重組質(zhì)粒pUC57-18S和提取的水稻干尖線蟲的基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀液后測試靈敏度，結(jié)果表明，該系統(tǒng)可檢測到1000 copies/μL的含目標(biāo)片段質(zhì)粒樣本，或是10^-1稀釋的水稻干尖線蟲基因組DNA提取樣本（圖6）。

圖6.RPA-Cas12a-Ab-LFA特異性、靈敏度驗證總結(jié)

總結(jié)：

總的來說，作者開發(fā)了一種新穎的RPA-Cas12a-Ab（-LFA）檢測方法，不依賴于復(fù)雜的設(shè)備和熟練的操作人員，RPA擴增和CRISPR/Cas12a反應(yīng)均可在37℃下完成，僅需一臺熒光分析儀或試紙條即可完成快速檢測，可在45分鐘內(nèi)獲得高靈敏、高特異性的檢測結(jié)果。此開發(fā)思路可廣泛應(yīng)用于其它作物感染疾病或不同病原體的檢測。

相關(guān)產(chǎn)品

Cas酶系列：

 恒溫擴增試劑盒及試紙條系列：

參考文獻(xiàn)：

[1].Zhang A, Sun B, Zhang J, et al. CRISPR/Cas12a Coupled With Recombinase Polymerase Amplification for Sensitive and Specific Detection of Aphelenchoides besseyi[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10: 912959.