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堿性蛋白酶測定試劑盒(AKP)(微量法100T/48S)

貨號 SH0588 售價(元) 1320
規(guī)格 100T/48S CAS號
  • 產(chǎn)品簡介
  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

SH0588

堿性蛋白酶測定試劑盒(AKP)(微量法100T/48S)

100T/48S

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義:

AKP是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類,屬于絲氨酸蛋白酶。此外,該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵,具有轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一,廣泛應(yīng)用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。

測定原理:

在堿性條件下,AKP水解酪蛋白生成酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍(lán);鎢藍(lán)在680nm有特征吸收峰,測定680nm吸光度增加速率,來計算AKP活性。

組成:

產(chǎn)品名稱

SH0588-100T/48S

Storage

試劑一:液體

100ml

4℃

試劑二:粉劑

1

4℃

試劑三:粉劑

1

4℃避光

試劑:粉劑

1

4℃

試劑五:液體

5ml

4℃

標(biāo)準(zhǔn)品:液體

1ml

4℃

說明書

一份

 

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加5ml蒸餾水溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10ml試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱15-30分鐘,該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。

試劑四:粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加20ml蒸餾水溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體1ml×1支,0.25μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,4℃保存。

自備儀器和用品:

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、0.5 ml EP管和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(ml)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1ml試劑一)冰浴勻漿,8000g4℃離心10min,取上清,即粗酶液。

血清或培養(yǎng)液:直接測定。

細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):試劑一體積(ml)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1ml試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

測定操作:

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到680 nm,蒸餾水調(diào)零。

2.試劑二、試劑三和試劑四置于40℃水浴保溫30min。

3. 對照管:0.5 ml EP管,加入20 μl粗酶液,40 μl試劑二,混勻后置于40℃水浴保溫10min;加入40μl試劑三,混勻后8000g ,4℃離心10min;取40μl上清液,加入新的EP管,再加入200μl試劑四,40μl試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μl680nm測定光吸收,記為A對照管。

4. 測定管:0.5 ml EP管,加入20μl粗酶液,40μl試劑三,混勻后置于40℃水浴保溫10min;加入40μl試劑二,混勻后8000g4℃離心10min;取40μl上清液,加入新的EP管,再加入200μl試劑四,40μl試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μl680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二)

5. 空白管:0.5 ml EP管,加入40μl蒸餾水,200μl試劑四,40μl試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μl680nm測定光吸收,記為A空白管。

6. 標(biāo)準(zhǔn)管:0.5 ml EP管,加入40μl標(biāo)準(zhǔn)品,200μl試劑四,40μl試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,吸取200μl680nm測定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

計算公式:

1. 按照樣本蛋白濃度計算

AKP活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min /mg prot= C標(biāo)準(zhǔn)品×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

AKP活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min /g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷W×V1÷V2÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

3. 按照液體體積計算

AKP活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min/ml=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

按照細(xì)胞數(shù)量計算

AKP活性單位定義:30℃104個細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

AKP活性(nmol/min /104 cell=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μ mol/ml標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;V反總:酶促反應(yīng)總體積,0.1ml;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/ml);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(ml),0.02 ml;V2:提取液總體積(ml),1ml;T:催化反應(yīng)時間(min),10min;W:樣品質(zhì)量(g)。

注意事項:

臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。

 

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