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堿性蛋白酶測(cè)定試劑盒（分光光度法 50T/24S）
| 貨號(hào) | SH0587 | 售價(jià)（元） | 696 |
| 規(guī)格 | 50T/24S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0587 |
堿性蛋白酶（Alkaline protease, AKP）活性測(cè)定試劑（分光光度法 50T/24S） |
50管/24樣 |
測(cè)定意義：
AKP是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類，屬于絲氨酸蛋白酶。此外，該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵，具有轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一，廣泛應(yīng)用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。
測(cè)定原理：
在堿性條件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍(lán)；鎢藍(lán)在680nm有特征吸收峰，測(cè)定680nm吸光度增加速率，來計(jì)算AKP活性。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0587-50T/24S |
Storage |
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試劑一：液體 |
90ml |
4℃ |
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試劑二：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑三：粉劑 |
1瓶 |
4℃避光 |
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試劑四：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑五：液體 |
10ml |
4℃ |
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標(biāo)準(zhǔn)品：液體 |
1ml |
4℃ |
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說明書 |
一份 |
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試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加10 ml蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入20 ml試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱15-30分鐘，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。
試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加50 ml蒸餾水溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體1ml×1支，0.25 μ mol/ml標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5 ml EP管、1ml玻璃比色皿和蒸餾水。
粗酶液提取：
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。
血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。
細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二、試劑三和試劑四置于40℃水浴保溫30min。
3. 對(duì)照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL試劑二，混勻后置于40℃水浴保溫10min；加入200μL試劑三，混勻后8000g ，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。
4. 測(cè)定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min；加入200μL試劑二，混勻后8000g ，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。（注意與對(duì)照管不同，先加試劑三，后加試劑二）
5. 空白管：取一支EP管，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑四200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A空白管。
6．標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于40℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
計(jì)算公式：
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
AKP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
AKP活性（nmol/min /mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
AKP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
AKP活性（nmol/min /g鮮重）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W
3. 按照液體體積計(jì)算
AKP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
AKP活性（nmol/min/ml）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷V1÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）
按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
AKP活性單位定義：30℃每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
AKP活性（nmol/min /104 cell）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量
C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/ml標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.5ml；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（ml），0.1 ml；V2：提取液總體積（ml），1ml；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min；W：樣品質(zhì)量（g）。
注意事項(xiàng)：
臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。