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染色質免疫共沉淀技術

        染色質免疫沉淀法(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是一種基于抗原抗體反應的特異性,從而起到選擇性地使DNA結合蛋白及其DNA靶標富集的作用,是在全基因組水平研究生命體組織或細胞內蛋白質與DNA相互作用的一種技術方法。近年來,隨著生物技術的迅速發(fā)展,ChIP 技術不斷發(fā)展和完善, 被廣泛應用于體內轉錄調控因子與靶基因啟動子上特異核苷酸序列結合方面的研究, 并成為在染色質水平研究基因表達調控的有效方法。特別是,此技術與 DNA 芯片和分子克隆技術相結合,可用于高通量篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶位點和研究反式作用因子在整個基因組上的分布情況,這將有助于深入研究DNA 與蛋白質相互作用的調控網絡。

                                  圖1. 染色質免疫沉淀

技術原理:

       在活細胞狀態(tài)下,當用甲醛處理時,相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNARNA)之間會產生共價鍵。細胞內,當TFPromoter相互結合時,它們必然靠的比較近或者契合在一起,這個時候用甲醛處理,能使它們之間產生共價鍵。固定的蛋白質-DNA復合物通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過抗原抗體的特異性識別反應沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序,篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

                                                                          圖2. 染色質免疫共沉淀原理

實驗流程:

 

1、交聯和裂解

作用:將細胞或組織進行固定(交聯)與裂解。

新鮮組織或活細胞中加入甲醛,目的是穩(wěn)定蛋白與DNA天然結合的狀態(tài),以免后續(xù)的實驗步驟破壞這種相互作用。在固定完成后,細胞或組織進行充分裂解。

2、染色質片段化

作用:細胞核材料片段化是獲得良好的 ChIP 分辨率的關鍵因素,理想情況下的片段大小在 200 800 bp對之間。剪切是最難控制的步驟之一。

 將染色質打斷成200-500 bp的小片段,在后續(xù)實驗中,結合了目的蛋白的片段將被抗體識別而保留,沒有結合目的蛋白的小片段則將被洗脫。在進行后續(xù)的實驗前,一般會將打斷后的樣品取一部分進行解交聯和DNA純化,通過瓊脂糖電泳或者毛細管電泳檢測其片段化范圍是否符合下游實驗的需求。


注意:此時可以停 ChIP。經過剪切/消化染色質后,可以將樣品于 -80°C 儲存。避免反復凍融。

3、免疫沉淀與DNA純化

作用:此步驟通過目的蛋白的特異抗體,對“DNA-目的蛋白復合物進行富集與洗脫。后續(xù)進行解交聯與蛋白消化,最后純化DNA分子。

 IP實驗除了有實驗組,還應該有陽性對照、陰性對照和空磁珠組,用以質控IP實驗流程是否合格。實驗組加入目的蛋白對應的抗體,抗體應該選用IP級別的抗體,WB抗體不一定能滿足IP實驗,具體參見抗體說明。陽性對照一般選用已知的組蛋白抗體;陰性對照采用與目的蛋白抗體相同種屬來源的血清;空磁珠組則不加任何抗體。


注意:此時可以停 ChIP。經過解交聯和/DNA 純化后,可以將樣品于 -20°C 儲存。

4、定量 DNA

作用:qPCR可以對目的片段進行定量分析。通過對目的序列的擴增,并與Input、陽性對照和陰性對照的量對比,就可以證明目的蛋白是否與預想的DNA序列發(fā)生了相互作用。

 ChIP-Seq 是將回收純化的DNA進行建庫測序,用于發(fā)現目的蛋白潛在結合的DNA序列。

注意事項

(1) 交聯:甲醛是最常用的交聯劑,具有形成可逆交聯的優(yōu)勢。然而,需控制交聯時間,過長的交聯時間可能導致超聲波破碎困難,甚至引起蛋白質與DNA的非直接結合。此外,經甲醛固定后,消化酶可能無法再進行消化。

 (2) 染色質切割:使用超聲破碎時,需要優(yōu)化條件以獲得200–500 bp的染色質片段。影響超聲破碎的因素包括樣品體積、超聲探頭深度、超聲強度和超聲時間。建議在4°C條件下進行超聲。核酸酶消化須嚴格監(jiān)控時間,以防止過度消化導致的亞核體形成,這會干擾后續(xù)DNA-蛋白質互作檢測。

 (3) 抗體選擇:選擇合適的抗體對實驗成功至關重要。推薦選用免疫沉淀級別(IP級別)的抗體,并根據需求選擇單克隆或多克隆抗體。單抗具有較高的特異性,但識別位點單一;若目的蛋白的識別位點被其它分子阻塞,則可能無法有效識別。根據所選抗體類型,配合使用Protein A或G磁珠。

 (4) 操作要點:整個實驗過程應盡量在4°C下進行,以保持樣本的穩(wěn)定性。操作時應避免產生氣泡,以防影響反應效率和結果準確性。

 (5) 結果分析:獲得DNA片段并不直接證明目的蛋白與DNA的直接結合。如果與目的蛋白形成復合物的其它蛋白與DNA有結合作用,也可能使DNA富集。因此,在解釋結果時需考慮其他可能性。

 








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