干細胞被認為是可用于建模和修復細胞功能的最強大和最靈活的細胞類型。目前干細胞被廣泛用于藥物篩選、細胞治療、疾病建模、毒理學和基因組編輯研究，可以說幾乎用于任何基礎和轉(zhuǎn)化研究領域。重要的是，其中許多技術依賴于將基因和/或蛋白質(zhì)成功引入干細胞，例如CRISPR/Cas9基因編輯。然而，干細胞，特別是多能干細胞（即能夠產(chǎn)生任何體細胞類型的細胞）特別難以轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染干細胞時最大的挑戰(zhàn)是細胞死亡，這在非病毒和病毒轉(zhuǎn)染遞送方法之后都有報道。此外，由于對細胞死亡的易感性和快速自我更新，干細胞的轉(zhuǎn)染效率可能低于其他細胞類型。
為了利用基于化學轉(zhuǎn)染進行基因操作的優(yōu)勢，理想的試劑需要實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率（在干細胞高于50%的情況下），同時最大限度地減少常見的干細胞細胞活力問題。
在此，本文報道了基于化學轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染試劑jetOPTIMUS?在三種難轉(zhuǎn)染的干細胞中的轉(zhuǎn)染效率的表現(xiàn)：間充質(zhì)干細胞（hMSCs）、小鼠胚胎干細胞（mESCs）和人類誘導多功能干細胞(hiPSCs)。JetOPTIMUS?基于陽離子聚合物，在各種原代細胞中達到DNA的高轉(zhuǎn)染效率，同時對細胞活率和形態(tài)的影響最小。此外，還評估了jetOPTIMUS對幾種市售和常用的培養(yǎng)物和底物系統(tǒng)上培養(yǎng)hPSCs的轉(zhuǎn)染效率。
結果與討論
1.jetOPTIMUS?確保原代間充質(zhì)干細胞在多次傳代時具有高轉(zhuǎn)染效率
圖1：在用jetOPTIMUS?轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細胞術分析評估轉(zhuǎn)染效率，該質(zhì)粒在培養(yǎng)四個后續(xù)傳代的原代人間充質(zhì)干細胞（hMSC）中。
2.jetOPTIMUS?在不影響小鼠胚胎干細胞生存能力的情況下實現(xiàn)了60%以上的轉(zhuǎn)染效率
圖2A：在原代mESCs中用jetOPTIMUS?轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細胞術分析評估轉(zhuǎn)染效率。
圖2B：在原代mESCs中用jetOPTIMUS?轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細胞術評估細胞活力。
3.jetOPTIMUS?在hiPSC中提供高達80%的轉(zhuǎn)染效率
圖3 A：用jetOPTIMUS?在hiPSC中轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細胞術分析評估轉(zhuǎn)染效率。
圖3B：用eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時的hPSCs中的GFP表達和相應的相位圖像。
4.評估jetOPTIMUS?搭配幾種hiPSC培養(yǎng)基和底物的轉(zhuǎn)染效率
表1A：jetOPTIMUS?在用幾種商業(yè)干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的hiPSC中的轉(zhuǎn)染效率從最高到最低。
表1B：jetOPTIMUS?在用幾種商業(yè)干細胞基質(zhì)培養(yǎng)的hiPSC中的轉(zhuǎn)染效率從最高到最低。
轉(zhuǎn)染方法：
質(zhì)粒pCMV_eGFP_Luc（6.4kb）編碼具有巨細胞病毒（CMV）啟動子的增強型綠色熒光蛋白（eGFP）/螢光素酶的融合蛋白，購自Clontech（#6169-1）。質(zhì)粒pEF1a_eGFP（4.9kb）編碼具有延伸因子-1α（EF1a）啟動子的eGFP，購自Ezyvec（#A626.1）。pCMV_eGFP_Luc用于轉(zhuǎn)染hMSC和mES，pEF1a_eGFP用于轉(zhuǎn)染hiPSC。
轉(zhuǎn)染前72小時，將hMSCs接種在24孔板中，每孔12000個細胞，接種在500μL相應的細胞維持培養(yǎng)基中，并在37°C下用5%CO2孵育。對于mESCs，在轉(zhuǎn)染前24小時，將細胞以每孔20000個細胞的速度接種在500μL mES培養(yǎng)基中的24孔板中，并在37°C下用5%CO2孵育。對于hiPSC，在轉(zhuǎn)染前24小時，將細胞接種在涂有Corning?Matrigel?基質(zhì)的24孔板中，該基質(zhì)含有2 mL mTeSR培養(yǎng)基和10μM ROCK抑制劑，每孔10萬個細胞，并在37°C和5%CO2下孵育。
對于hMSCs和hiPCS，在轉(zhuǎn)染前30分鐘，移除培養(yǎng)基并用500μL的MSCBM代替?，不添加補充物，或分別用500μL含有10μM ROCK抑制劑的hiPSCs培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱。
相關產(chǎn)品：
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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101000051 |
jetOPTIMUs |
0.1 ml |
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101000027 |
jetPRIME? |
0.1 ml |
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101000036 |
INTERFERin? |
0.1 ml |
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101000056 |
jetMESSENGER? |
0.1 ml |
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101000010 |
PULSin? |
0.4 ml |
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101000040 |
in vivo-jetPEI? |
0.1 ml |
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101000122 |
In vivo-jetRNA?+ transfection reagent |
1 mL |