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      2020年，Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士所發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas9“基因剪刀”被授予諾貝爾化學(xué)獎。隨后，CRISPR-Cas技術(shù)得到快速發(fā)展，在很短的時間內(nèi)完成了由基礎(chǔ)理論到初步科學(xué)驗證，進入到多種不同的應(yīng)用領(lǐng)域。

     在IVD領(lǐng)域，基于CRISPR-Cas為基礎(chǔ)所開發(fā)的新興診斷被用于傳染病和癌癥監(jiān)測中，并以其快速、便攜、經(jīng)濟、高效等特點為分子檢測帶來革新。讓我們一起來總結(jié)CRISPR技術(shù)中的幾位"大主角"，cas9、cas12、cas13、cas14蛋白所延伸的分子診斷技術(shù)。為行業(yè)內(nèi)的學(xué)者、科研人員和工作者帶來一些啟發(fā)。如何選擇自己實驗中合適的cas蛋白酶本文將要闡述下幾種酶的區(qū)別。

Cas9蛋白

      Cas9是一種DNA內(nèi)切酶，Cas9內(nèi)切酶必須在向?qū)?/span>RNA分子的引導(dǎo)下對DNA進行切割，這是因為這些向?qū)?/span>RNA分子含有與靶DNA序列互補的序列，稱之為PAM序列。Cas9蛋白精確的平端切割位點位于PAM上游3個核苷酸位置，形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域負責(zé)切割與crRNA互補配對的那一條DNA鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域負責(zé)切割另外一條非互補DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB）形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會借助同源重組機制(homologous recombination)或者非同源末端連接機制(non-homologous end joining)對斷裂的DNA進行修復(fù)，進而實現(xiàn)DNA片段的敲除或敲入。

Cas9的應(yīng)用：

      Cas9含有兩個具有切割活性的結(jié)構(gòu)域：HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域，其中HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補的DNA鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域切割非互補鏈。RuvC結(jié)構(gòu)域可分為三個亞結(jié)構(gòu)域：RuvC I、RuvC II和RuvC III，RuvC I接近于Cas9的氨基端，RuvC II和RuvC III位于HNH結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)。僅對Cas9中的RuvC I進行突變，具體而言就是讓RuvC I的兩個關(guān)鍵氨基酸殘基中的一個轉(zhuǎn)換成丙氨酸（D10A或H840A），從而得到Cas9切口酶（Cas9 nickase, Cas9n）。這種切口酶不能切割非互補DNA鏈，僅能切割與crRNA互補的DNA鏈，能夠明顯減少脫靶效應(yīng)，同時保持高效的基因修飾。 

通過點突變的方式使Cas9的兩個結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性，其中RuvC催化結(jié)構(gòu)域的第10位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔?/span>D10A）以及HNH催化結(jié)構(gòu)域的第840位組氨酸突變?yōu)楸彼幔?/span>H840A），Cas9蛋白將失去核酸內(nèi)切酶活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開始，從而抑制基因表達；將dCas9結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會對基因組DNA造成不可逆轉(zhuǎn)的改變。

Cas12 蛋白

      CRISPR–Cas12a蛋白，以前稱為Cpf1，是一種內(nèi)切核酸酶，可以通過向?qū)?/span>RNA進行編程，以靶向互補的DNA序列。在與靶DNA結(jié)合后，CRISPRCas12a蛋白在每條靶DNA鏈中誘導(dǎo)切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。除了誘導(dǎo)靶DNA的順式切割之外，靶DNA結(jié)合還誘導(dǎo)非靶DNA的反式切割。因此，CRISPR Cas12a-RNA向?qū)?fù)合物可以提供針對入侵核酸（例如噬菌體和質(zhì)粒）的序列特異性免疫。類似于CRISPR/Cas9，Cas12a已被重新用作原核和真核細胞中可編程基因組編輯和轉(zhuǎn)錄控制的遺傳工具。此外，其反式切割活性已應(yīng)用于高靈敏度核酸檢測。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的脫靶率將比Cas9低得多，并且因為它與Cas9的諸多不同，它將能與CRISPR/Cas9互補，從而擴大CRISPR/Cas系統(tǒng)的工具箱，使基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)具有更強的普適性和編輯能力。

      Cas12b核酸酶（又名C2c1）是依賴于RNA介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，在靶標(biāo)DNA存在PAM的情況下，可特異地切割靶標(biāo)雙鏈DNA。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，且來源于嗜酸耐熱菌且切割活性較高的Alicyclobacillus acidoterrestris。Cas12b的最佳切割反應(yīng)溫度為48 ℃。和同家族的Cas12a類似，Cas12b也識別5'-TTN的PAM序列，切割DNA后也產(chǎn)生粘性末端；然而，Cas12b是雙RNA導(dǎo)向，依賴于crRNA和tracrRNA（或連接后形成的sgRNA）。此外，Cas12b不僅可以應(yīng)用于靶標(biāo)dsDNA的切割，還可以用于靶標(biāo)核酸的快速檢測，詳見HOLMESv2核酸快檢技術(shù)。

Cas13 蛋白

      Cas13蛋白可進一步分為4個亞型，即CRISPR-Cas13a,b,c,d。除了Cas13c的相關(guān)研究目前還不充分外，另外3中Cas蛋白已經(jīng)有了比較廣泛的研究和應(yīng)用。

Cas13a核酸酶（又名 C2c2）是依賴于 RNA 介導(dǎo)的 RNA 內(nèi)切核酸酶。在靶標(biāo)單鏈 RNA 存在 PFS序 列的情況下，可特異地切割靶標(biāo) RNA。此外，Cas13a 還具有依賴于靶標(biāo)單鏈 RNA 的反式切割活性，可用于開發(fā)靶標(biāo)核酸的快速檢測試劑盒。例如，MIT的張鋒團隊便利用 Cas13a 蛋白開發(fā)了名為“SHERLOCK”的下一代分子診斷系統(tǒng)。對于細菌而言，Cas13a這種反式切割活性是有意義的。若細菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細胞死亡或休眠狀態(tài)，以限制感染在整個群體中的傳播。像Cas13a一樣，Cas13b僅需要單個向?qū)?/span>RNA就能靶向目的序列，此外，Cas13b能夠同時靶向多個RNA轉(zhuǎn)錄本。

而此后發(fā)現(xiàn)的Cas13d，具有更高的效率、更低的脫靶率，更重要的是，Cas13d相比其他Cas13家族成員具有更小的尺寸，能夠更容易包裝到病毒載體中，因此具有更好的遞送優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

Cas14 蛋白

      除了上述幾種具有靶向切割能力的Cas蛋白之外，近期發(fā)現(xiàn)的Cas14 也具有類似的功能。

Cas14a核酸酶是一種內(nèi)切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA（或sgRNA）的引導(dǎo)下，特異結(jié)合并切割靶標(biāo)ssDNA，且無需PAM位點。相比于其他的Cas蛋白，Cas14蛋白的分子量普遍較小（400-700aa）；與Cas12類似，Cas14a也可以結(jié)合靶標(biāo)核酸并激活其ssDNA反式切割活性。研究人員認為，Cas14的切割對象是單鏈DNA，而不是雙鏈DNA，因此未必是良好的基因組編輯工具。不過，他們認為Cas14可用在DETECTR診斷工具中。

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