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     在單細(xì)胞懸液制備中，最難制備的莫屬原生質(zhì)體制備了。為解決這一難題，今天小歐根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)，給大家?guī)?lái)一次教科書(shū)級(jí)別的關(guān)于如何制備高質(zhì)量原生質(zhì)體的分享。

原生質(zhì)體介紹

1、什么是原生質(zhì)體

     原生質(zhì)體 (protoplast)：脫去細(xì)胞壁的細(xì)胞稱為原生質(zhì)體，它是一個(gè)生物工程學(xué)的概念，是組成細(xì)胞的一個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)單位，動(dòng)物細(xì)胞也可算做原生質(zhì)體。在細(xì)胞學(xué)歷史上，“細(xì)胞”(cell) 一詞最早由 Hooke 提出的，意為“小室”，后來(lái)發(fā)現(xiàn)了原生質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)與 Hooke 時(shí)期不同了，1880 年由 Hanstein 提出“原生質(zhì)體”一詞。由于細(xì)胞一詞的出現(xiàn)較原生質(zhì)體早，故沿用至今。

2、獲得原生質(zhì)體有什么重要作用

    原生質(zhì)體應(yīng)用非常廣泛，例如：由于細(xì)胞壁會(huì)阻止 DNA 進(jìn)入細(xì)胞，原生質(zhì)體被廣泛用于 DNA 轉(zhuǎn)化；可用于研究生物膜，包括高分子和病毒的攝??；用于體細(xì)胞的變異克??；使用原生質(zhì)體融合技術(shù)將原生質(zhì)體用于植物育種等；此外，在某些細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白的植物的原生質(zhì)體可用于熒光活化細(xì)胞分選（FACS），方便保留特定波長(zhǎng)發(fā)熒光的細(xì)胞。  

    另外，原生質(zhì)體是一種非常好的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、植物生理生化過(guò)程研究和分子機(jī)制的研究（包括研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁合成、蛋白質(zhì)分泌以及細(xì)胞程序化死亡等生物學(xué)過(guò)程），以及生產(chǎn)有用的代謝產(chǎn)物、構(gòu)建植物融合細(xì)胞、創(chuàng)制多倍體等。

現(xiàn)在已有的基于原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括蛋白亞細(xì)胞定位分析、基因瞬時(shí)表達(dá)分析、啟動(dòng)子活性分析、離子吸收實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)互作驗(yàn)證（如 Bi-FC、FRET 和蛋白質(zhì)免疫共沉淀）等。

3、目前原生質(zhì)體獲得存在哪些限制

     植物細(xì)胞壁不易破壞分解，葉綠體含量太高，碎片雜質(zhì)占比太高以及容易被染菌等，成為當(dāng)下植物解離獲取原生質(zhì)體的幾大阻礙，如何高效獲取高質(zhì)量原生質(zhì)體成為當(dāng)下亟需攻克的實(shí)驗(yàn)難題。

酶解法

      酶解法以其得率高、活率好、雜質(zhì)少的特點(diǎn)毋庸置疑成為原生質(zhì)體制備的首要方法。下面就由小歐向大家分享一下植物原生質(zhì)體解離的獨(dú)家秘方。

酶解法分離原生質(zhì)體的靈魂就是酶分解細(xì)胞壁。植物細(xì)胞壁的組成分主要是纖維素、半纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等。選擇植物原生質(zhì)體分離用酶主要有：纖維素酶 R-10、半纖維素酶 、果膠酶 Y-23、離析酶 R-10 及崩潰酶等 , 其中纖維素酶 R-10、果膠酶 Y-23 最為常用。葉片類組織樣本解離時(shí)，在酶解液中添加半纖維素酶可以提高消化效率；根系組織解離時(shí)，在酶解液中添加離析酶并適當(dāng)提高果膠酶 Y-23 的濃度可以提高消化效率。

在前期條件摸索時(shí)，可以先確立以纖維素酶 R-10、果膠酶 Y-23 為基礎(chǔ)酶解液配方，根據(jù)出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)情況來(lái)對(duì)酶解液進(jìn)行優(yōu)化，以下是詳細(xì)說(shuō)明：

(旁白：福利來(lái)啦，小歐首次公開(kāi)酶解液的配方哦，絕對(duì)的史無(wú)前例呀。)

獨(dú)家配方

1、確定基礎(chǔ)酶解液配方（添加量需要通過(guò)終濃度結(jié)合使用的具體品牌的試劑信息進(jìn)行計(jì)算）：

2、取材篩選：葉片組織取材時(shí)優(yōu)先選取顏色為鮮綠色且葉片較為柔軟的部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（如下圖所示）；

根部組織取材優(yōu)先選取狀態(tài)飽滿、水嫩的根部進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；莖部組織取材時(shí)需要注意剝?nèi)ビ许g性的外表皮后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)摸索前期組織量要盡可能的多，推薦鮮重 0.25-2 g 的組織進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。

水稻節(jié)間剝?nèi)ネ獗砥ず笮Ч麍D

水稻黃化葉片解離摸索使用組織圖

3、酶解消化：酶解的過(guò)程實(shí)質(zhì)就是通過(guò)物理方法使植物組織有足夠的切口暴露在酶解液中，通過(guò)酶解液分解細(xì)胞壁繼而使原生質(zhì)體游離于切口處，然后通過(guò)搖床等溫和振蕩的方法幫助已經(jīng)無(wú)壁的原生質(zhì)體從切口處游離至酶解液中，最后通過(guò)富集純化得到高質(zhì)量的原生質(zhì)體懸液。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)的 FAQ

Q1: 酶解得到的原生質(zhì)體活率低有哪些原因？要如何避免這種現(xiàn)象？

A1: 酶解得到原生質(zhì)體活率低可以分為以下幾個(gè)方向：

1. 酶解 30 min-1 h 鏡檢原生質(zhì)體活率低。首先要檢查酶解液的 PH 是否低于 5.5，酶解液 PH 較低會(huì)影響原生質(zhì)體狀態(tài)；其次檢查酶解過(guò)程中是否進(jìn)行了避光措施，不采取避光措施會(huì)對(duì)原生質(zhì)體質(zhì)膜造成傷害從而導(dǎo)致活性降低。

2. 酶解時(shí)間超過(guò)某一時(shí)間后活率出現(xiàn)下降，這種情況是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的原生質(zhì)體活率下降。

上圖為 PH 試紙檢測(cè)酶解液 PH

Q2: 酶解原生質(zhì)體得率很低是什么原因造成的？

A2: 原生質(zhì)體得率低最大可能是酶解液未能很好的接觸切口，比如水稻葉片組織，本身不易浸入酶解液中，可以通過(guò)真空泵輔助的方法使酶解液進(jìn)入組織內(nèi)部，從而提高原生質(zhì)體得率；還有可能是原生質(zhì)體沒(méi)能很好的從切口處游離出去，可以使用更高轉(zhuǎn)速的搖床來(lái)輔助原生質(zhì)體釋放，或者通過(guò)對(duì)酶解后組織的輕微擠壓來(lái)幫助原生質(zhì)體釋放。

葉片浸潤(rùn)于酶解液中   

真空泵輔助葉片浸入酶解液

Q3: 如何降低原生質(zhì)體懸液中的碎片占比？

A3: 目前雖可以通過(guò)梯度離心的方法對(duì)原生質(zhì)體懸液進(jìn)行純化，但這種方法的得率低，需要大量的原生質(zhì)體來(lái)支撐，因此降低碎片最好的方法是優(yōu)化取材部位，可以通過(guò)剝?nèi)ネ獗砥?、棄去狀態(tài)不好的組織(失水組織、被擠壓后的組織、質(zhì)地堅(jiān)硬的組織)、使用鋒利的刀片劃切組織代替剪刀處理組織來(lái)減少碎片的投入量，也更能保障原生質(zhì)體的活率。

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