Hypoxyprobe缺氧探針試劑盒常見問題分析
缺氧探針試劑盒的如何選擇？
Hypoxyprobe公司缺氧探針試劑盒核心組分為：缺氧探針（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探針的抗體。不同試劑盒中的探針和抗體標記不同。南京沃博生物是Hypoxyprobe公司代理經(jīng)銷商?，F(xiàn)貨常備以下幾款缺氧探針試劑盒。
★ Hypoxyprobe?-1 Kit 此試劑盒適合于免疫熒光和免疫組化和流式檢測，探針抗體不帶標記，需要客戶自己搭配相應(yīng)的二抗，比如：免疫組化，需要搭配抗小鼠IgG-HRP 二抗，免疫熒光或流式可搭配FITC-抗小鼠IgG-HRP（或者相應(yīng)的其他標記二抗）。此試劑盒應(yīng)用靈活方便，適合同時對組化和熒光檢測有需求的客戶，也方便客戶搭配不同的抗體標記，滿足不同的實驗需求。
★Hypoxyprobe?-1 Plus Kit 此試劑盒適用于免疫熒光和免疫組化和流式檢測。不需要搭配二抗。如果做免疫熒光，只需要用到探針和FITC標記的探針抗體，這2個組分。如果做免疫組化，需要用到第3個組分：兔抗FITC-HRP標記的抗體。該試劑盒的優(yōu)點是，同時滿足客戶做免疫熒光和免疫組化要求，不需要客戶自己搭配二抗。
★Hypoxyprobe?-1 Omni Kit 此試劑盒與Hypoxyprobe?-1 Kit 不同的是探針的抗體來源不同，此試劑盒中的抗體為兔來源，探針抗體不帶標記，需要客戶自己搭配相應(yīng)的二抗。比如：免疫組化，需要搭配抗兔IgG-HRP 二抗，免疫熒光或流式可搭配FITC-抗兔IgG-HRP（或者相應(yīng)的其他標記二抗）。
★Hypoxyprobe? Green Kit 此試劑盒適合于免疫熒光和流式檢測。探針抗體為FITC直接標記，可直接用于免疫熒光檢測（直接免疫熒光）或流式檢測，不需要搭配二抗。需要注意研究的組織如有自發(fā)熒光（綠光），比如GFP(一些轉(zhuǎn)基因研究的客戶)，不適合這款試劑盒。可以選擇其他熒光標記的試劑盒，比如：Hypoxyprobe? RedAPC（紅光）。
★Hypoxyprobe? RedAPC此試劑盒適合于免疫熒光和流式檢測。探針抗體為FITC直接標記，可直接用于免疫熒光檢測（直接免疫熒光）或流式，操作簡便，不需要搭配二抗。
☆缺氧探針（派諾硝唑） 探針如何溶解？
派諾硝唑（Pimonidazole HCl）是弱堿性鹽酸鹽，水溶性非常好，建議溶解于中性緩沖液（生理鹽水或蒸餾水都可以）。這種水溶性特征有利于在腹腔和靜脈注射時，控制免疫劑量在0.1-0.5 mL之間。（派諾硝唑溶解度：116mg/ml）
☆在缺氧標記時派諾硝唑（Pimonidazole HCl）免疫劑量是多少？
派諾硝唑與缺氧組織結(jié)合程度取決于硝基咪唑的還原率和組織相對派諾硝唑的結(jié)合率（結(jié)合率與派諾硝唑的濃度和作用時間成正比）。硝基咪唑的還原率很難預(yù)測，但是組織相對派諾硝唑的探針的結(jié)合率可以預(yù)測。以下是研究表明的給出的派諾硝唑的使用濃度：
1）在球狀組織可以檢測到強信號的缺氧標記染色，（ Exposure = 58mg/kg x 1 hour = 58mg/kg-hour.）
2）免疫劑量：0.5g/m2(14mg/kg)，在人腫瘤組織和正常細胞檢測到強信號的缺氧標記染色。血漿中的派諾硝唑的半衰期是5小時。（Exposure = 14 mg/kg x 5 hours = 70 mg/kg-hour.）
3）在小鼠腫瘤組織檢測到強信號的缺氧標記染色，免疫劑量：60mg/kg,血漿中Pimonidazole的半衰期是15min。（Exposure = 60mg/kg x 0.25 hours = 15 mg/kg - hour.）
總之，對于大小一致的小動物，比如：實驗室大鼠或小鼠，推薦的派諾硝唑的用量是：60mg/kg(kg:動物體重)，這個劑量是經(jīng)濟有效的劑量。
由于血流效應(yīng)，沒有毒性反應(yīng)或沒有氧濃度變化的的小鼠或大鼠，劑量控制在30 mg/kg to 400 mg/kg 。對于移植腫瘤（在小鼠后肢）派諾硝唑探針劑100mg/kg。
需要注意的是：大于100mg/kg的劑量僅用于移植腫瘤。
對于體重不一致的大動物，具體用量取決于接觸表面積。對于人的來說，推薦的用量是：0.5g/m2 ，而對于狗0.28g/m2。
☆缺氧探針（Hypoxyprobe-1）是否能進入缺氧腦組織或腫瘤組織。
Hypoxyprobe-1 是水溶性的，其對應(yīng)游離基醇/水系數(shù)8.5，因此缺氧探針能夠自由進入腦組織以及腦腫瘤組織。
☆派諾硝唑是否是體內(nèi)檢測缺氧的合適的標記物？
派諾硝唑被認為是缺氧檢測的金標準標記物。其優(yōu)點是：
1）水溶性好（116mg/ml 鹽水），這樣靜脈或腹腔免疫動物時，可以把免疫量（體積）控制在較小體積。其他的標記物，例如： CCI-103F 探針水溶性為10mol 或者更低，這個探針常用于花生油，DMSO 配成乳劑用于腹腔注射，避免血液稀釋。
2）穩(wěn)定性好。固態(tài)探針4℃或常溫性質(zhì)非常穩(wěn)定，可以保存數(shù)年。高濃度的探針水溶液，避光4℃保存可以保存數(shù)年。探針的抗體，可以再4℃保存1年以上。
3）非危險化學(xué)品。對于小鼠，派諾硝唑探針的半數(shù)致死量（LD50）是：728mg/kg，因此被認為是低毒性的非危險化學(xué)品。
4）適用于各種免疫檢測。派諾硝唑探針檢測可以用各種檢測方法檢測，例如：免疫熒光、免疫組化，ELISA ，流式等。
☆派諾硝唑的探針抗體是否可以用于小鼠組織的檢測？
是的。對于福爾馬林固定的石蠟組織，我們推薦HRP 標記的F（ab）2二抗（例如：HRP - Goat F(ab')2 Anti-Mouse Ig）。這樣會降低背景，可以用于不同種屬的動物檢測。
☆探針激活和缺氧細胞結(jié)合原理是什么？
腫瘤乏氧細胞還原能力強，當具有電子親合力的硝基咪唑主動擴散透過細胞脂膜，在細胞內(nèi)硝基還原酶作用下，硝基被還原，還原產(chǎn)物與大分子物質(zhì)不可逆結(jié)合，滯留在組織內(nèi)。而正常含氧細胞親電子硝基咪唑還原產(chǎn)物立即被氧化，從而用硝基咪唑類化合物在腫瘤內(nèi)的代謝程度來反映腫瘤的乏氧。
☆缺氧探針試劑盒中抗體（IgG1）濃度是多少？
Hp1-x盒子中抗體濃度：60ug/ml。Hp2-x, Hp6-x, Hp7-x,HP8-x,HP10-x中抗體濃度為500ug/ml，其它盒子中，兔來源的抗血清，沒有純化后的抗體IgG濃度確定確定。
☆探針注射后，收貨組織的時間是什么時候？
在收獲組織過程中，組織會逐漸缺氧與探針結(jié)合，可能會出現(xiàn)一些假陽性。從時間上來講，組織與探針結(jié)合時間要比收獲組織時間長很多，因此在收貨組織這個短時間內(nèi)，信號會很弱，因此在此期間探針濃度是有限的，出現(xiàn)的假陽性是可以忽略的。
對于人組織的研究，活組織檢查通常要在探針免疫后16-24小時后。探針在人血漿中的半衰期是5小時，因此16-24小時代表3-5個半衰期。也就是說在收貨組織時：只有1/8 到1/32的初始探針濃度殘留，組織固定后，較大程度的減少非特異性結(jié)合。
在其他的一些的人組織研究中，活組織檢查通常要在探針免疫1-1.5小時，然后組織立即液氮固定。這種操作方法，背景也會很低。盡管這個時候收獲組織：探針濃度在1.5-4小時內(nèi)相對較高，組織固定時間相對探針和組織的作用時間太短，因此不會造成高背景。
對人組織的一些研究一些研究經(jīng)驗，對實驗研究是很有指導(dǎo)意義的。探針免疫小鼠后，半衰期只有0.25小時。這種情況下，1-2小時收獲組織后，低溫快速冷凍固定，會終止非特異性結(jié)合。
☆探針結(jié)合的氧分壓臨界值≤10mgHg是如何確定的？
A:在固體組織中很難確定硝基咪唑的氧化率。迄今為止，比較好的實驗方法是來自于Gross et al.’s，比較氧電極測量氧分壓和射線自顯跡法測量放射物標記法。甲氧甲基硝基咪唑結(jié)合的顆粒密度10mmHg氧分壓下，大量增加。其他的研究Chou et al. 也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。因此10 mm Hg是一個可信的探針與氧結(jié)合的臨界值。
已知的關(guān)于缺氧探針在小鼠組織的半衰期
小鼠類型
血漿半衰期（min）
參考文獻
WH 雄性
22 ± 1
1
WHT雌性
22
2
C3H/He 雄性
28 ± 2; 23.5; 31.3; 24.6
3; 4; 5; 6
☆ 動物內(nèi)體的氧氮反應(yīng)是否影響派諾硝唑的標記效果？
派諾硝唑的Piperidine基團很容易氧化成N-氧化物代謝物。原則上，會影響派諾硝唑的對缺氧組織的標記效率。動物體內(nèi)，缺氧探針的氧氮反應(yīng)是通過含黃素單氧化酶（FMO）激活完成的。FMO在不同動物中的分布是不同的，因此在不同動物種屬血漿中的氮氧化物水平是不同的。有趣的是，派諾硝唑的注射途徑（靜脈或口服）受血漿中氧氮物濃度影響很小。研究表明用：口服和靜脈注射派諾硝唑探針給狗的腫瘤（用CCI-103F作為缺氧標記的對照探針）。強氧化劑例如：過氧酸是由于超氧化物陰離子與NO反應(yīng)，也可以氧化派諾硝唑探針。盡管這樣，NO的形成不會影響派諾硝唑的探針效果。
首先，通過還原血紅素鐵蛋白復(fù)合物 ，氧氮反應(yīng)是可逆的以及通過組織還原酶，比如組織黃嘌呤脫氫酶以及還原細胞色素還原，派諾硝唑的氧化是有限的。
第二，通過其他探針的對照試驗說明，對缺氧的標記程度不受血漿中氧氮化合物影響。
第三， 氧氮衍生物與派諾硝唑抗體沒有交叉反應(yīng)，因此對派諾硝唑的檢測沒有任何干擾。
☆如果探針標記染色結(jié)果與組織缺氧結(jié)果不一致怎么辦？
迄今為止，通過派諾硝唑探針染色結(jié)果與組織缺氧檢測結(jié)果一般是一致的。
一般來講，如果對派諾硝唑的標記結(jié)果有疑問。一種方法是，對注射派諾硝唑的動物吸氧10%，如果吸氧10%后的動物派諾硝唑探針結(jié)合程度顯著提高，有可能缺氧有可能是由于派諾硝唑結(jié)合造成的。另一種方法是，用兩種缺氧探針標記檢測干預(yù)前后，組織氧壓的變化。
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