細(xì)胞系的培養(yǎng)與傳代實(shí)驗(yàn)指南
細(xì)胞系的培養(yǎng)與傳代
簡介（INTRODUCTION）
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，須進(jìn)行傳代再培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料（MATERIALS）
o 試劑（REAGENTS）
完全培養(yǎng)基（RPML1640或DMEM），胰蛋白酶消化液,1XPBS
o 試劑準(zhǔn)備（REAGENT SETUP）
1XPBS:NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml；雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L,高溫滅菌后4℃保存,也可配制10XPBS室溫保存；
完全培養(yǎng)基：90%液體培養(yǎng)基+10%小牛血清（特殊需要會標(biāo)注在培養(yǎng)基說明書上）；
胰蛋白酶消化液：0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA加入1XPBS，終體積為100ml，pH7.4，0.22um濾過除菌分裝，4℃保存。
o 器械（EQUIPMENT）
EP管、15ml離心管、離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟（PROCEDURE）
貼壁細(xì)胞傳代與培養(yǎng) ?預(yù)期時(shí)間消耗：30min
1. 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代，并將培養(yǎng)基與PBS置于37℃水浴，
胰酶消化液室溫放置，點(diǎn)燃酒精燈，將所需試劑擺放到相應(yīng)位置；
2．用1ml槍頭棄去培養(yǎng)皿中上清液，加入3ml 1XPBS洗滌兩遍，加入胰酶消化液1ml，輕輕搖晃后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中1min（可酌情增加時(shí)長），可以放在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓即可；
3．加入6ml培養(yǎng)基并吹打培養(yǎng)皿底，將細(xì)胞移入離心管中，1000rpm 3min離心；
4．棄上清，加入1ml培養(yǎng)基吹打均勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后取需要的細(xì)胞數(shù)量加入到新的培養(yǎng)基中，搖晃均勻；
5．放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，可以每天觀察，期間如果細(xì)胞培養(yǎng)基營養(yǎng)不夠可更換成新鮮培養(yǎng)基。
▲關(guān)鍵步驟：控制好消化時(shí)間，有些貼壁細(xì)胞貼壁較緊，需要確保吹打均勻。
懸浮細(xì)胞傳代與培養(yǎng) ?預(yù)期時(shí)間消耗：30min
1．倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代，并將培養(yǎng)基與PBS置于37℃水浴，胰酶消化液室溫放置
2．點(diǎn)燃酒精燈，將所需試劑擺放到相應(yīng)位置
3．將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基移入15ml離心管中，800rpm離心5min
4．棄上清，用2ml 1XPBS洗滌兩次，每次800rpm離心5min
5．加入1ml完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取需要的細(xì)胞數(shù)量加入到新的培養(yǎng)基中，搖晃均勻
▲關(guān)鍵步驟：吹打細(xì)胞需要輕柔，并且混合均勻。
針對性建議（TROUBLESHOOTING）
細(xì)胞培養(yǎng)條件會根據(jù)不同細(xì)胞要求不同，以下是總結(jié)的條件：
1. 293：人腎上皮細(xì)胞， 10%FBS DMEM，從培養(yǎng)皿板底吹下傳代；
2. BHK‐21：幼地鼠腎細(xì)胞， 10%FBS DMEM，胰酶消化傳代；
3. NK92：人的 NK 細(xì)胞系（懸浮細(xì)胞系）， 12.5%FBS +12.5%horseserum α‐mem， 100U/ml 的 IL‐2；
4. MCF‐7：人乳腺癌細(xì)胞， 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
5. L929： 1:3 傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)去上清。長滿后取走上清，換新鮮培養(yǎng)基，過 2,3 天可以取用，一共可以取兩批；
6. HT‐29：結(jié)腸癌細(xì)胞。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
7. 293T： 10%FBS DMEM，從培養(yǎng)皿板底吹下傳代；
8. DC2.4： 10%FBS DMEM，胰酶消化傳代；
9. Hela: 人宮頸癌細(xì)胞。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代。 2ml 長三天滿；
10. Thp1: 10%FBS 1640 培養(yǎng)， 3 天一代，細(xì)胞長過影響狀態(tài)，小瓶留 2ml 傳代，大瓶留 7ml 傳代；
11. HepG2:人肝癌細(xì)胞系。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
12. LO2: 正常 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
13. Huh 7: 人肝癌細(xì)胞系。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
14. Hepa1‐6(mice liver cancer cells): 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
15. NCTC 1149(mice liver cells): 10% horse serum DMEM， PBS 沖洗。
沃博生物代理的NEWZERUM新西蘭品牌血清品牌具有百年歷史，血源來源新西蘭和澳大利亞具有出口資質(zhì)的屠宰場，最大單批次量可達(dá) 2000L,確保同一批次質(zhì)量同時(shí)提供充足的血清供應(yīng)七次無菌過濾，最后三次為0.1 μm無菌過濾處理，進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體、病毒及病毒抗體檢測，符合國際動物協(xié)會要求。
產(chǎn)品詳情
產(chǎn)品名稱
貨號
規(guī)格
目錄價(jià)格
特級胎牛血清
FBS-P500
500ML
6000
特級胎牛血清
FBS-P100
100ML
1200
描述：
內(nèi)毒素含量極低 <5EU/ml(國際規(guī)定：特級胎牛血清<10 EU/ml)
極利于細(xì)胞的生長和傳代 ，適合各種細(xì)胞培養(yǎng)
每個(gè)批號血清均具有完整的檢驗(yàn)報(bào)告
七次無菌過濾，最后三次為0.1 μm無菌過濾處理
進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體、病毒及病毒抗體檢測，符合國際動物協(xié)會要求
每個(gè)批號血清庫存量達(dá)500-1000升，保證供應(yīng)充足
特點(diǎn)：
極低內(nèi)毒素，支持各類難養(yǎng)細(xì)胞;
同批號跟蹤發(fā)貨，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)連續(xù)穩(wěn)定;
海外廠家直供，市場價(jià)格透明;
十年誠懇信譽(yù)，溫暖售后保證!
建議使用范圍：
科研使用; 細(xì)胞培養(yǎng)
推薦血清融化方法：
操作
溫度
100ml
500ml
1000ml
第一步
室溫
35 min
90 min
100 min
15—20℃水浴
5 min
18 min
20 min
第二步
20℃水浴
15 min
25 min
30 min
第三步
37℃水浴
20 min
35 min
45 min
注意：
? 在水浴過程中，血清的平面要完全浸在水中。在融化過程中要慢慢搖動，使血清混勻，但不要產(chǎn)生泡沫!
?胎牛血清不推薦熱滅活。
儲存：
-20°C凍存，4°C保存不超過1個(gè)月。反復(fù)凍融會破壞血清中有效成分，影響血清品質(zhì)。
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱
貨號
規(guī)格
目錄價(jià)格
優(yōu)級胎牛血清
FBS-E500
500ML
2500
優(yōu)級胎牛血清
FBS-E100
100ML
1200
碳吸附胎牛血清
FBS-CA500
500ML
詢價(jià)
碳吸附胎牛血清
FBS-CA100
100ML
詢價(jià)
透析型胎牛血清
FBS-DI500
500ML
詢價(jià)
透析型胎牛血清
FBS-DI100
100ML
詢價(jià)
干細(xì)胞胎牛血清
FBS-ES500
500ML
詢價(jià)
干細(xì)胞胎牛血清
FBS-ES500
100ML
詢價(jià)