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酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid assay）技術(shù)原理
檢測(cè)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid assay）是用于體內(nèi)研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具，常用的如GAL4為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，使用酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4來檢測(cè)轉(zhuǎn)錄激活后的蛋白相互作用。某些轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）由兩個(gè)可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，N端有一個(gè)147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，BD），C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）結(jié)合，而AD能激活UAS下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的BD或AD不能激活基因轉(zhuǎn)錄，兩者只有通過某種方式結(jié)合在一起形成完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。酵母雙雜交系統(tǒng)主要利用酵母GAL4的這個(gè)特性通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱、瞬間的作用都能通過報(bào)告基因敏感的檢測(cè)到。酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用：
對(duì)新的與已經(jīng)蛋白相互作用的鑒定
對(duì)預(yù)測(cè)蛋白相互作用的確認(rèn)
對(duì)蛋白相互作用區(qū)域的鑒定
酵母雙雜交系統(tǒng)重要元件介紹（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
一、誘餌（the bait）
為了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推薦使用質(zhì)粒pGBKT7；
要調(diào)查三元蛋白復(fù)合物，推薦使用含2個(gè)MCS區(qū)域的三雜交載體，能表達(dá)GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二個(gè)感興趣蛋白，在bait和prey蛋白之間發(fā)揮橋梁作用。
二、檢測(cè)蛋白作用的四個(gè)報(bào)告基因
Matchmarker gold系統(tǒng)是采用4個(gè)報(bào)告基因/3個(gè)不同bait識(shí)別序列的雙雜交系統(tǒng)。其采用新型穩(wěn)定的酵母雙雜交抗生素- 金擔(dān)子素Aureobasidin A （AbA）（貨號(hào)：M0129），可有效殺死非抗性克隆，從而大大降低背景克隆生長(zhǎng)。同時(shí)有效縮減假陽(yáng)性，由于人和prey蛋白單獨(dú)將結(jié)合引起假陽(yáng)性都需要識(shí)別3個(gè)不同序列，激活4個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)。
4個(gè)報(bào)告基因分別是：1個(gè)AbA抗生素篩選報(bào)告基因，2個(gè)營(yíng)養(yǎng)篩選報(bào)告基因，1個(gè)藍(lán)白斑篩選報(bào)告基因。
1） AUR1-C
AUR1基因的主要突變版，能夠表達(dá)肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生作用促使GAL4轉(zhuǎn)錄激活，AUR1-C基因進(jìn)行表達(dá)。釀酒酵母中此基因的表達(dá)孵育其對(duì)高毒抗生素金擔(dān)子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景極其低，這一篩選報(bào)告子由于單一的營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告子。
2） HIS3
Y2HGold菌株不能合成組氨酸，從而無法在缺少這一必須氨基酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。當(dāng)誘餌和誘捕蛋白相互作用，Gal4反應(yīng)性的His3表達(dá)促使細(xì)胞合成組氨酸并能在His缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
3） ADE2
Y2HGold菌株無法在不含腺嘌呤的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但當(dāng)兩個(gè)蛋白相互作用，Ade2表達(dá)被活化，細(xì)胞能在Ade缺陷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
4） MEL1
MEL1編碼α-半乳糖苷酶，存在許多酵母菌內(nèi)的天然表達(dá)蛋白。當(dāng)雙雜交發(fā)生，MEL1表達(dá)和分泌，在底物X-α-Gal（貨號(hào)：M5831-100mg）存在的情況下，酵母菌落變?yōu)樗{(lán)色。
三、三個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)（three different binding sites）
Y2HGold菌株三個(gè)啟動(dòng)子控制4個(gè)報(bào)告基因是不相關(guān)的，除UAS區(qū)域的短蛋白結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合Gal4 DNA-BD。因此，誘捕蛋白（文庫(kù)蛋白或靶蛋白）與UAS內(nèi)部或邊緣的不相關(guān)序列作用（假陽(yáng)性）就會(huì)自動(dòng)被篩查出來。
Matchmarker酵母菌株的報(bào)告基因構(gòu)造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C報(bào)告基因分別由三個(gè)完全異源的Gal4反應(yīng)啟動(dòng)元件-G1，G2，M1操控。而啟動(dòng)子內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)是不同的，雖然每一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與Gal4識(shí)別的17-mer共有序列相關(guān)聯(lián)。
酵母雙雜交系統(tǒng)操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
完整的Matchmarker篩選過程包含以下步驟：
第一步：執(zhí)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)；
第二步：誘餌載體的構(gòu)建及自我激活和毒性檢測(cè)；
第三步：篩選Mate&Plate文庫(kù)
第四步：確認(rèn)和闡釋結(jié)果
酵母雙雜相關(guān)產(chǎn)品：
貨號(hào)
產(chǎn)品
規(guī)格
單價(jià)/元
M1397
IPTG
10g
419
M6090
X-Gal
1g
426
M5831-100mg
X-α-Gal
100mg
1280
M5831-250mg
X-α-Gal
250mg
2199
S2705
MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸
250mg
680
S2805
MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸
1g
1780
M0129
Aureobasidin
A（AbA）金擔(dān)子素A （1mg/ml）
1mg
1378
M0135
Aureobasidin A （AbA）金擔(dān)子素A（凍干粉）
10mg
6800
M1405-1g
硫酸慶大霉素Gentamicin Sulfate Salt
1g
382
M1405-5g
硫酸慶大霉素Gentamicin Sulfate Salt
5g
1150
M8071
5-Fluoroorotic Acid (5-FOA) 5-氟乳清酸
1g
424
M8271
5-Fluoroorotic Acid (5-FOA) 5-氟乳清酸
5g
1524
M8471
5-Fluoroorotic acid monohydrate (5-FOA) 5-氟乳清酸一水合物
500mg
347
M8671
5-Fluoroorotic acid monohydrate (5-FOA) 5-氟乳清酸一水合物
1g
612
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