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測定意義：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶家族，廣泛分布于真菌和高等植物中，具有較強的氧化還原能力，在紙漿生物漂白，環(huán)境污染物降解和木質(zhì)纖維素降解以及生物檢測方面有非常廣泛的應(yīng)用。

測定原理：

漆酶分解底物ABTS產(chǎn)生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數(shù)遠大于底物ABTS，測定ABTS自由基的增加速率，可計算得漆酶活性。

試劑組成和配制：

工作液：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加15ml試劑一溶解；用不完的試劑4℃保存一周。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心30min，取上清，置冰上待測。

2、細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

3、細胞培養(yǎng)液：直接檢測。

測定步驟：

60℃水浴20min后冷卻至室溫，取200μl反應(yīng)液于微量石英比色皿/96孔板中測定420nm處吸光值A，△A=A測定管-A對照管。

注意事項

1、極少數(shù)樣本在60℃水浴20min后會出現(xiàn)沉淀，可經(jīng)過8000g 25℃離心10min后，取上清檢測，例如成熟的水稻葉片樣本。

2、為確保檢測準確性，若ΔA大于1，將樣本用提取液稀釋2~10倍后重新檢測，計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

酶活性計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 9.26×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 9.26×△A÷W

3．按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義：每104個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /104 cell）= ×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T= 9.26×△A÷細胞數(shù)量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反總÷V樣÷T= 9260×△A

ε：ABTS毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.3ml；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.03ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18.52×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 18.52×△A÷W

3．按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義：每104個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /104 cell）= ×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 18.52×△A÷細胞數(shù)量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反總÷V樣÷T= 18520×△A

ε：ABTS毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.3ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.045ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min。