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測定意義：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝、細胞壁組分代謝以及衰老時細胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

測定原理：

β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5ml蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、培養(yǎng)液等液體樣本：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃準確水浴30min

充分混勻，400nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

β-GAL活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為y =0.00543x -0.0027；x為標準品濃度（nmol/ml），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min /g鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.123×(ΔA +0.0027)

（4）按液體體積計算：

單位的定義：每ml液體樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min /ml)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷V樣÷T

=61.39×(ΔA+0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。