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測定意義：

肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝、腎的生理狀態(tài)。另外，氨基酸還能反應(yīng)灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。

測定原理：

氨基酸的α-氨基可與水合茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通過測定570 nm吸光度，來計算氨基酸含量。

組成：

試劑三臨用前加入2 ml無水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入28ml蒸餾水混勻，避光保存。

試劑四臨用前加5 ml蒸餾水，充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品臨用前加10 ml蒸餾水，充分溶解。1μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1ml玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

樣品中AA提取：

1、按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進行室溫勻漿，然后轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來水冷卻后，8000g，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清等液體：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到570 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取EP管，加入50μl蒸餾水，500μl試劑二，500μl試劑三和50μl試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測定吸光值，記為A空白管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，500μl試劑二，500μl試劑三和50μl試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

4. 測定管：取EP管，加入50μl上清液，500μl試劑二，500μl試劑三和50μl試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測定吸光值，記為A測定管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

氨基酸含量計算公式：

（1）按照樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量（μmol /g鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

（2）按照樣本蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（V樣×Cpr）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

（3）按照細胞數(shù)量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數(shù)量）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /ml）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1μmol/ml；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.05 ml；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.05 ml；V樣總：樣品提取液總體積，1ml，Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml。

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢。

2. 為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個樣做預(yù)實驗，如果測定的吸光值過高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在570nm處無吸收峰，因此，570nm處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4．最低檢出限為100μmol/L。