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產(chǎn)品信息

貨號	名稱	規(guī)格
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
GMP-M072-01A	mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase, GMP Grade	2500U
GMP -S062	SAM (32mM), GMP Grade	0.5ml
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
M062-YH01-01A	Vaccinia Capping System	500U
M072	mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase	2500U/2500U×5
M082	Cap 1 Capping System	10T/100T

產(chǎn)品簡介

      牛痘病毒加帽體系利用牛痘病毒加帽酶及相關(guān)組分，將7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。使用酶促反應(yīng)為RNA加帽是一種簡單有效的方法，且帽結(jié)構(gòu)與天然Cap 0結(jié)構(gòu)完全一致，能顯著改善用于體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和顯微注射的RNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。這種酶由兩個亞基（D1和D12）組成，D1亞基執(zhí)行RNA三磷酸酶和鳥苷轉(zhuǎn)移酶的功能，D12亞基執(zhí)行鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，它們對于添加一個完整的Cap 0結(jié)構(gòu)m7Gppp5′N都是必須的（圖1）。
      由牛痘病毒加帽酶構(gòu)建的帶帽RNA產(chǎn)品具有“cap 0”結(jié)構(gòu)。通過在加帽反應(yīng)中同時使用mRNA Cap 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以轉(zhuǎn)化為“ cap 1”結(jié)構(gòu)。 mRNA Cap 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶通過將甲基從供體分子SAM轉(zhuǎn)移到cap 0- RNA 5’端緊鄰帽結(jié)構(gòu)的第一個核苷酸的2'-O位置，從而從Cap 0-RNA制備Cap 1-RNA。


     圖1. 參與mRNA 加帽的酶促途徑。Cap 0 結(jié)構(gòu) RNA 的產(chǎn)生需要牛痘病毒加帽酶：該酶兼具三磷酸酶、鳥苷轉(zhuǎn)移酶和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基供體。一旦產(chǎn)生了Cap 0 結(jié)構(gòu)，就可以通過2'-O-核糖甲基轉(zhuǎn)移酶進一步修飾以產(chǎn)生Cap 1 結(jié)構(gòu)。本圖引自Michael Beverly , Amy Dell, Parul Parmar, Leslie Houghton et al (2016). Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 

     本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應(yīng)，使加帽反應(yīng)在 1h 之內(nèi)完成，效率接近 100%，并且保證正確的方向。IVT 推薦使用近岸蛋白質(zhì) T7 High Yield RNA Transcription kit（貨號：E131）。 
產(chǎn)品用途：
體內(nèi)或體外翻譯前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端標(biāo)記。 
提高 RNA 的翻譯效率； 
改善 mRNA 在顯微注射和轉(zhuǎn)染后的表達。 
應(yīng)用實例：

注意事項：   
SAM：SAM 在pH 7-8，37°C條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。 
RNA：在加帽體系使用之前，應(yīng)將體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的 RNA 進行純化并溶解于 RNase-free 水中，不能將 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他鹽溶液中。 
RNA 二級結(jié)構(gòu)：一些 RNA 轉(zhuǎn)錄本可能形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)（同源二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)），如二級結(jié)構(gòu)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄本的 5'端會影響加帽效率。在與加帽酶反應(yīng)之前加熱 RNA 可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5′端的二級結(jié)構(gòu)，如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時間延長至 10min，加帽反應(yīng)時間可延長至 60min。 
Cap 0-和 Cap 1-mRNA：Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端緊鄰帽結(jié)構(gòu)的第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核細(xì)胞中，該甲基化是天然加帽過程的一部分，Cap 1 結(jié)構(gòu)提高了 mRNA 的翻譯效率。

Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白質(zhì) E. coli Poly(A) Polymerase（貨號：M012）進行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進行 RNA 轉(zhuǎn)染實驗前做純化處理。 
RNase Inhibitor：在配置反應(yīng)體系時，可以加入 0.5 μl 近岸蛋白質(zhì) RNase 抑制劑（貨號：E125），同時去掉等體積的 RNase-free水。 
For research and manufacturing use only.