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Gibco? Zeocin? Selection Reagent 博萊霉素
| 貨號(hào) | R25001 | 售價(jià)（元） | 3800 |
| 規(guī)格 | 8 x 1.25 mL | CAS號(hào) | 11006-33-0 |
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產(chǎn)品信息：
品牌
貨號(hào)
品 名
規(guī)格
價(jià)格
Invitrogen
R25001
Zeocin博萊霉素
1.25 ml
518
Invitrogen
R25001
Zeocin博萊霉素
8 x 1.25 ml
3800
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商業(yè)名稱，其中文名稱博來(lái)霉素是一種銅離子螯合的糖肽抗生素（來(lái)源于鏈霉菌Streptomyces verticillus的突變株），銅離子的存在使其呈藍(lán)色，此銅螯合的形式為無(wú)活性。當(dāng)抗生素進(jìn)入細(xì)胞后，二價(jià)銅離子（Cu2+）被還原為一價(jià)銅離子（Cu+），并被細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。博來(lái)霉素是作用譜廣泛，對(duì)細(xì)菌、真核微生物、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞具很強(qiáng)的毒性。博來(lái)霉素常用作一種非常有效的工具抗生素，用來(lái)篩選攜帶Sh ble抗性基因并能穩(wěn)定表達(dá)分子量為13.665 kDa的一種博來(lái)霉素抗性蛋白的細(xì)胞株。博來(lái)霉素是的用量為 50-2000 ug/ml（通常 300 ug/ml），具體取決于細(xì)胞類型。
提供無(wú)菌溶液形式的Zeocin，濃度是100mg/ml，使用起來(lái)更加方便，只需直接加入培養(yǎng)基到所需工作濃度即可。
產(chǎn)品性質(zhì)
分子式（Formula）：C55H85O21N20S2Cu - HCl
Cas: 11006-33-0
分子量（Molecular Weight）：1535
外觀（Appearance）：藍(lán)色粉末
內(nèi)毒素：＜1 EU/mg
純度（Purity）：>90%(HLPC)
溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）
應(yīng)用參考濃度：
1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過(guò)5g/L）
2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）
3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞系而不同）
使用步驟參考
一、細(xì)胞對(duì)Zeocin敏感性的確定（殺滅曲線建立）
重新鋪板或者將滿盤(pán)細(xì)胞重新分盤(pán)，使得細(xì)胞密度約25%，按照8個(gè)平板/組準(zhǔn)備，培養(yǎng)24h，去除舊培養(yǎng)基。
加入含不同濃度Zeocin的篩選培養(yǎng)基，Zeocin濃度可設(shè)置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個(gè)濃度做3個(gè)平行；也可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系，設(shè)置不同的濃度梯度。
每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細(xì)胞的比例。選擇在合適時(shí)間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細(xì)胞的濃度為最加工作濃度?！咀ⅰ浚喝羰请y以在顯微觀察下區(qū)分活細(xì)胞，建議使用臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)計(jì)算存活細(xì)胞的數(shù)量，以確定Zeocin的最適濃度。
二、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用100mm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
轉(zhuǎn)染后，用預(yù)熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染48-72h后，用含有最加濃度Zeocin（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細(xì)胞。為了更好的鑒定和篩選細(xì)胞集落，建議將細(xì)胞按比例稀釋成一系列濃度。
【注】：若待篩選細(xì)胞對(duì)Zeocin的抗性明顯強(qiáng)于大部分細(xì)胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞分盤(pán)，置于37°C孵育2-3h，使得細(xì)胞貼壁。然后將細(xì)胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細(xì)胞置于37°C孵育。4°C孵育細(xì)胞的目的是短時(shí)間內(nèi)終止細(xì)胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細(xì)胞。
每3-4天更換新鮮的選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細(xì)胞集落。
挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進(jìn)行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴(kuò)大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細(xì)胞密度近100%。
三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的維持培養(yǎng)
可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞：
1）使用含相同劑量Zeocin的篩選培養(yǎng)基來(lái)維持培養(yǎng)；
2）降低Zeocin劑量為原來(lái)的一半進(jìn)行維持培養(yǎng)；
3）使用正好能預(yù)防敏感細(xì)胞生長(zhǎng)但不足以致死的Zeocin劑量來(lái)維持培養(yǎng)【根據(jù)殺滅曲線來(lái)判斷】。