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Fluo-4, AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-4，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

Fluo-4是可見光激發(fā)波長Ca2+熒光探針Fluo-3的改良版本，通過將Fluo-3結(jié)構(gòu)上的氯離子（Cl-）替換為電子吸引力更強的氟離子（F-），使得最大激發(fā)波長往短波長偏移10nm左右。正由于這個波長更接近氬激光器的波長，則當使用氬激光器來激發(fā)探針Fluo-4，能夠得到更強的熒光強度，比Fluo-3強一倍。另外，F(xiàn)luo-4的Ca2+親和力幾乎接近Fluo-3（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM），因此，使用上幾乎同F(xiàn)luo-3。Ca2+結(jié)合后的最大激發(fā)波長為494nm，最大發(fā)射波長為516nm?？赏ㄟ^激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀來檢測胞內(nèi)鈣離子水平的變化。

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針的優(yōu)勢：

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點：

1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

2） 具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低對活細胞的光毒性。

3）Ca2+依賴性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。

6）無光譜偏移。

Fluo-4, AM相比較于Fluo-3的優(yōu)勢：

1）激發(fā)和發(fā)射波長往短波長偏移10nm，更接近氬激光器的波長，。因此，當使用488nm進行熒光激發(fā)，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍。

2）50μg小包裝供應(yīng)，使用方便，且能很好保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針的優(yōu)勢：

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點：

1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

2） 具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低對活細胞的光毒性。

3）Ca2+依賴性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。

6）無光譜偏移。

Fluo-4, AM相比較于Fluo-3的優(yōu)勢：

1）激發(fā)和發(fā)射波長往短波長偏移10nm，更接近氬激光器的波長，。因此，當使用488nm進行熒光激發(fā)，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍。

2）50μg小包裝供應(yīng)，使用方便，且能很好保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

產(chǎn)品性質(zhì)

CAS 號（CAS NO.）:273221-67-3

分子式（Molecular Fomular）:C51H50F2N2O23

分子量（Molecular Weight）：1096.95

Ex/Em (nm)：494nm/516nm

純度（Purity）：≥98%

外觀（Appearance）:粉末

使用說明：

1. （可選）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末中加入0.5ml DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. Hanks balanced salt solution（HBSS,不含Ca2+, Mg2+）

操作方法

1）Fluo-4,AM母液的配制：向 Fluo-4, AM中加入適量DMSO，配制成1-5mM的儲存液，DMSO的加入量根據(jù)Fluo-4,AM（MW1096.95）分子量進行計算（如：若配制成1mM的母液，需向50ug Fluo-4,AM中加入45.6ul DMSO）。

【注】：溶解用的DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導致 AM 體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。

2）Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS將Fluo-4,AM稀釋成1-5μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 ml濃度為4 μM工作液，用1 ml HBSS溶液稀釋4 μl 1mM母液即可。

【注】：① 推薦該探針加載濃度在4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實驗要求進行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

② Fluo-4,AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復凍存。

3）（可選）如果Fluo-4進入細胞的效果不好，可向 Fluo-4, AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fluo-4, AM 在 HBSS中聚合并能幫助其進入細胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fluo-4,AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議將其加入儲存液長期保存。

4）取出預培養(yǎng)的細胞，除去培養(yǎng)基，使用 HBSS 溶液洗滌細胞 3次。

【注】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低 Fluo 4-AM 進入細胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

5）將 Fluo-4, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。在37℃培養(yǎng)10-60min，然后除去 Fluo 4-AM 工作液。

【注】：關(guān)于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30分鐘，看熒光效果：如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

6）用HBSS溶液洗滌細胞 3 次，以充分去除殘留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細胞。

7）37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細胞內(nèi)的完全去酯化作用。

8）用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，激發(fā)波長 494 nm，發(fā)射波長 516 nm。

Fluo-4- AM  cell permeant

注意事項

1）熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）本Fluo-4,AM 容易吸潮，從冰箱取出后，請確認在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）第一次使用時，建議母液即配即用。試劑溶解后盡可能在短時間內(nèi)使用，以保證實驗效果。

4）母液遇水極易分解，如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成5μl/管，用封口膜封口，并用鋁箔紙包裹，放在一個密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。

5）建議您在正式實驗前先摸索一下細胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時間等，找到最佳實驗條件。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

7）保存條件：-20℃

產(chǎn)品相關(guān)：