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中文別名（Chinese synonym）  溴化噻唑藍(lán)四氮唑；3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)；

英文別名（English synonym） 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide;Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide;Thiazoyl blue tetrazolium bromide;

CAS號(hào)（CAS NO.） 298-93-1

分子式（Formula）  C18H16N5SBr

外觀（Appearance） 淡黃色至橙色粉末

分子量（Molecular weight）  414.3

純度（purity）   ≥98%

熔點(diǎn)（Melting point）187℃

溶解性（Solubility）     溶于水，甲醇

MTT 溶液的配制方法

         通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避光，覺(jué)得這樣比較好。

         需要注意的是，MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。

         MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。

MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.

配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4,定容1L。

普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：

1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)

胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

2: 培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。

3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h，

終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。

每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。

4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為

橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟

貼壁細(xì)胞：

1: 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000-

10000 孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。

2: 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，

細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午

加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，

可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5: 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免

疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

7: 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介

質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細(xì)胞：

1: 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)?span>①補(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培

養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640）

2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用

WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）

4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

5、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

注意事項(xiàng)：

(1) 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

(2) 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔

內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

(3) 設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，

最后比色以空白調(diào)零。

(4) MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。

(5) 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測(cè)細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適

根據(jù)書上說(shuō)的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于

DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定

(6) 一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測(cè)吸光值

保存條件：

      4℃避光保存。

注意事項(xiàng)：

      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。