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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,可導(dǎo)致急性或慢性肝病,嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)引發(fā)肝硬化、肝衰竭甚至肝癌 。HBV通過(guò)血液、母嬰傳播和性接觸進(jìn)行傳播,全球已有超過(guò)2億人感染,其中部分人發(fā)展為慢性乙型肝炎。作為病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志,HBV DNA檢測(cè)在評(píng)估病毒傳染性和抗病毒療效方面至關(guān)重要 。盡管實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)已廣泛用于HBV DNA的檢測(cè),但該方法也存在一些缺陷 ,例如檢測(cè)周期較長(zhǎng)、需要大型設(shè)備等。因此,HBV DNA檢測(cè)在提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)速度等方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)。
本研究旨在基于RAA-CRISPR/Cas13a系統(tǒng)建立一種快速、靈敏且特異性良好的HBV DNA檢測(cè)方法,為臨床監(jiān)測(cè)HBV的感染以及評(píng)估治療效果提供了新的思路。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.試劑與儀器:HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒(博邁德生物科技有限公司);HBV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所);瓊脂糖(索萊寶科技有限公司);Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液和GoldenViewTM(博邁德生物科技有限公司);TIANamp病毒DNA/RNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司);RAA核酸擴(kuò)增試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒(眾測(cè)生物科技有限公司);乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒(圣湘生物);凝膠成像儀和 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Roche Light Cycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀器(瑞士羅氏公司)。
2. HBV DNA 質(zhì)粒的構(gòu)建:從HBV數(shù)據(jù)庫(kù)( https://hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex)中下載了全長(zhǎng)HBV DNA序列。使用Jalview軟件比較了HBV-P區(qū)序列。比較后,選擇具有95%以上保守性的HBV DNA序列,然后以含有部分 HBV 基因組的質(zhì)粒(GenBank ID:LC456126.1 位點(diǎn):625~758)和 pUC57 為模板構(gòu)建HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒,并根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)crRNA和RAA引物。HBV保守序列篩查結(jié)果:5′-TTTCGCAAAATT CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGG-3′(134 bp)。
3. CRISPR-Cas13a體系檢測(cè)HBV DNA的原理及構(gòu)建:從臨床樣本的血漿中提取總HBV DNA,使用篩選出來(lái)的RAA引物對(duì)靶向的HBV DNA區(qū)域進(jìn)行RAA擴(kuò)增,然后通過(guò)T7轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為單鏈RNA(single strand RNA,ssRNA)。在Cas13a檢測(cè)系統(tǒng)中,目的ssRNA片段可以被Cas13-crRNA復(fù)合物特異性識(shí)別和結(jié)合,以觸發(fā)Cas13a活性并切割熒光報(bào)告探針釋放熒光信號(hào),這些熒光信號(hào)可以通過(guò)熒光儀器進(jìn)行檢測(cè)并獲得熒光信號(hào)的強(qiáng)弱,從而反映出樣本中HBV DNA的存在。整個(gè)檢測(cè)流程大約需要1 h。
4. RAA引物和crRNA設(shè)計(jì):從已獲得的HBV保守序列中設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性的RAA 擴(kuò)增引物和3 條 crRNA 序列( 表1 、 2 )。所有序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
5.血漿HBV DNA的提?。菏褂肨IANamp病毒DNA/RNA試劑盒從HBV陽(yáng)性患者血漿樣本中提取20 μl HBV DNA,提取的HBV DNA存放在-80 ℃冰箱備用。
6. DNA瓊脂糖電泳:將1 g瓊脂糖與100 ml 1×Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液混合,加熱溶解后冷卻至50~60 ℃,然后加入10 μl GoldenView TM核酸染料。將RAA擴(kuò)增產(chǎn)物上樣凝膠孔后,在170 V電泳約20 min,取出凝膠塊并放入凝膠成像儀中進(jìn)行檢查和圖像保存。
7. RAA引物和crRNA的篩選:使用3對(duì)引物分別對(duì)10 3拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行RAA擴(kuò)增,通過(guò)觀察CRISPR-Cas13a檢測(cè)的熒光信號(hào)值篩選擴(kuò)增效率最高的RAA引物。10 3拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒分別使用crRNA1、crRNA2和crRNA3進(jìn)行CRISPR-Cas13a檢測(cè),觀察反應(yīng)結(jié)束時(shí)(60 min)的熒光強(qiáng)度,篩選檢測(cè)效率最高的crRNA做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
8. RAA 擴(kuò)增:RAA核酸擴(kuò)增試劑盒反應(yīng)總體積為50 μl,其中上游引物(10 mmol/L)、下游引物(10 mmol/L)和 MgCl 2各2 μl,DNA 模板5 μl。反應(yīng)條件為 37 ℃ 30 min,陰性對(duì)照為無(wú)酶無(wú)菌水。
9. CRISPR-Cas13a檢測(cè):CRISPR-Cas13a檢測(cè)體系包括:NTP混合物(2.5 mmol/L)2 μl,LwCas13a蛋白(25 nmol/L)1 μl,RNA酶抑制劑1 μl,T7 RNA聚合酶0.5 μl,4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(20 mmol/L)0.5 μl,MgCl 2溶液(10 mmol/L)0.25 μl,crRNA(2 μmol/L)1.5 μl,熒光報(bào)告RNA(2 nmol/L)2.5 μl,無(wú)酶無(wú)菌水(ddH 2O)10.75 μl,擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl,總體積25 μl。其中crRNA序列為:GGGGAU UUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUACGAACCACUGAACAAAUGGCACUAGU,反應(yīng)條件為 37 ℃ 1 h,陰性對(duì)照為無(wú)酶無(wú)菌水。
10.靈敏度評(píng)價(jià):使用梯度稀釋HBV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(初始濃度為1×10 6 IU/ml,稀釋為1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0和1×10 -1 IU/ml)和HBV陽(yáng)性臨床樣本(1×10 6、1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0 IU/ml和未檢測(cè)到HBV DNA)作為檢測(cè)模板,利用已建立的CRISPR-Cas13a檢測(cè)方法在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn),每次運(yùn)行2個(gè)重復(fù)(復(fù)孔)。
11.特異性評(píng)價(jià):為評(píng)價(jià)CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測(cè)HBV DNA的特異性,本研究收集了其他常見(jiàn)的傳染性疾病的陽(yáng)性臨床樣本各6例(HDV、HEV和HIV),提取總RNA后,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)后的擴(kuò)增產(chǎn)物作為檢測(cè)模板進(jìn)行交叉反應(yīng)。該試驗(yàn)在不同的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次,每次運(yùn)行2個(gè)重復(fù)。
12. qPCR檢測(cè):使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒對(duì)不同病毒載量的HBV DNA陽(yáng)性患者樣本進(jìn)行qPCR檢測(cè)。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min熱變性;95 ℃ 30 s,55 ℃30 s,72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃自動(dòng)延伸10 min。根據(jù)Ct值判斷結(jié)果:Ct值≤35為陽(yáng)性,35<Ct值<40需重新檢測(cè)確認(rèn),Ct值無(wú)結(jié)果或>40為陰性。
13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用GraphPad prism 8.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量采用表示,多組間的比較采用方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn),2組間的比較采用配對(duì) t檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn), P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
一、RAA引物和crRNA篩選瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了9組RAA引物(F1、F2、F3和R1、R2、R3排列組合)的可用性和擴(kuò)增效率。根據(jù)亮度結(jié)果( 圖1 ),HBV-RAA-F2、HBV-RAA-R2配對(duì)的RAA引物對(duì)表現(xiàn)出最佳的擴(kuò)增效率(17 602.2±1 437.2),與陰性對(duì)照(5 791.64±472.8)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( t=11.04, P<0.01)。crRNA1、crRNA2和crRNA3的熒光強(qiáng)度分別為200.7±9.9、181.1±8.8和229.0±4.3,其中crRNA3的熒光值均高于crRNA1( t=4.536, P<0.01)和crRNA2( t=8.479, P<0.01),使用crRNA3用于后續(xù)檢測(cè)( 圖2 )。
二、靈敏度和特異性的評(píng)價(jià)使用CRISPR-Cas13a檢測(cè)60 min時(shí),1×10 0 IU/ml的HBV DNA熒光強(qiáng)度(23.7±11.5)與陰性對(duì)照(1.8±0.3)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( t=47.96, P<0.01)( 圖3A )。反應(yīng)進(jìn)行 60 min 時(shí),HBV陽(yáng)性患者樣本的檢測(cè)相對(duì)熒光值與陰性對(duì)照的熒光值分別為196.3±7.6和4.8±1.1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( t=13.63, P<0.01)。HIV、HEV、HDV陽(yáng)性患者樣本的檢測(cè)熒光值分別為5.4±1.5、4.9±1.6和5.0±1.0,與陰性對(duì)照的熒光值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P>0.05, 圖3B )。因此,該法檢測(cè)HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度可達(dá)到1×10 0 IU/ml。
實(shí)驗(yàn)討論:
本研究將RAA與CRISPR檢測(cè)相結(jié)合建立了RAA-CRISPR 的精準(zhǔn)檢測(cè)HBV DNA的方法,建立的檢測(cè)方法對(duì)HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)靈敏度為1 IU/ml;對(duì) HBV DNA 陽(yáng)性樣本的檢測(cè)靈敏度也達(dá)到<10 IU/ml。本研究還對(duì)70 個(gè)HBV DNA陽(yáng)性臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,CRISPR-Cas13a 檢測(cè) HBV DNA的陽(yáng)性率為 100%(70/70)。與qPCR檢測(cè)系統(tǒng)比較,CRISPR-Cas13a系統(tǒng)能更快地檢測(cè)出HBV DNA陽(yáng)性患者。本研究建立的檢測(cè)方法可以快速精準(zhǔn)地檢測(cè)HBV DNA,但也存在一些不足之處。由于 CRISPR系統(tǒng)的“附帶切割”具有非特異性,即切割持續(xù)且隨機(jī),因此對(duì)HBV DNA只能進(jìn)行定性檢測(cè),無(wú)法定量分析。本研究將RAA快速擴(kuò)增與CRISPR-Cas13a相結(jié)合檢測(cè)HBV DNA,靈敏度高、特異性好。該方法還有望替代目前基于qPCR的 HBV DNA診斷方法,降低HBV檢測(cè)成本且有助于臨床HBV患者的早期干預(yù),推動(dòng)乙型肝炎的診斷和管理,為未來(lái)HBV的POCT檢測(cè)提供方向。