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乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，可導(dǎo)致急性或慢性肝病，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)引發(fā)肝硬化、肝衰竭甚至肝癌 。HBV通過(guò)血液、母嬰傳播和性接觸進(jìn)行傳播，全球已有超過(guò)2億人感染，其中部分人發(fā)展為慢性乙型肝炎。作為病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志，HBV DNA檢測(cè)在評(píng)估病毒傳染性和抗病毒療效方面至關(guān)重要 。盡管實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）已廣泛用于HBV DNA的檢測(cè)，但該方法也存在一些缺陷 ，例如檢測(cè)周期較長(zhǎng)、需要大型設(shè)備等。因此，HBV DNA檢測(cè)在提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)速度等方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)。
本研究旨在基于RAA-CRISPR/Cas13a系統(tǒng)建立一種快速、靈敏且特異性良好的HBV DNA檢測(cè)方法，為臨床監(jiān)測(cè)HBV的感染以及評(píng)估治療效果提供了新的思路。
實(shí)驗(yàn)方法：
1.試劑與儀器：HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒（博邁德生物科技有限公司）；HBV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所）；瓊脂糖（索萊寶科技有限公司）；Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液和GoldenViewTM（博邁德生物科技有限公司）；TIANamp病毒DNA/RNA提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）；RAA核酸擴(kuò)增試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒（眾測(cè)生物科技有限公司）；乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（圣湘生物）；凝膠成像儀和 PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Roche Light Cycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀器（瑞士羅氏公司）。
2. HBV DNA 質(zhì)粒的構(gòu)建：從HBV數(shù)據(jù)庫(kù)（ https：//hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex）中下載了全長(zhǎng)HBV DNA序列。使用Jalview軟件比較了HBV-P區(qū)序列。比較后，選擇具有95%以上保守性的HBV DNA序列，然后以含有部分 HBV 基因組的質(zhì)粒（GenBank ID：LC456126.1 位點(diǎn)：625~758）和 pUC57 為模板構(gòu)建HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒，并根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)crRNA和RAA引物。HBV保守序列篩查結(jié)果：5′-TTTCGCAAAATT CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGG-3′（134 bp）。
3. CRISPR-Cas13a體系檢測(cè)HBV DNA的原理及構(gòu)建：從臨床樣本的血漿中提取總HBV DNA，使用篩選出來(lái)的RAA引物對(duì)靶向的HBV DNA區(qū)域進(jìn)行RAA擴(kuò)增，然后通過(guò)T7轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為單鏈RNA（single strand RNA，ssRNA）。在Cas13a檢測(cè)系統(tǒng)中，目的ssRNA片段可以被Cas13-crRNA復(fù)合物特異性識(shí)別和結(jié)合，以觸發(fā)Cas13a活性并切割熒光報(bào)告探針釋放熒光信號(hào)，這些熒光信號(hào)可以通過(guò)熒光儀器進(jìn)行檢測(cè)并獲得熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，從而反映出樣本中HBV DNA的存在。整個(gè)檢測(cè)流程大約需要1 h。
4. RAA引物和crRNA設(shè)計(jì)：從已獲得的HBV保守序列中設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性的RAA 擴(kuò)增引物和3 條 crRNA 序列（ 表1 、 2 ）。所有序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
5.血漿HBV DNA的提取：使用TIANamp病毒DNA/RNA試劑盒從HBV陽(yáng)性患者血漿樣本中提取20 μl HBV DNA，提取的HBV DNA存放在-80 ℃冰箱備用。
6. DNA瓊脂糖電泳：將1 g瓊脂糖與100 ml 1×Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液混合，加熱溶解后冷卻至50~60 ℃，然后加入10 μl GoldenView TM核酸染料。將RAA擴(kuò)增產(chǎn)物上樣凝膠孔后，在170 V電泳約20 min，取出凝膠塊并放入凝膠成像儀中進(jìn)行檢查和圖像保存。
7. RAA引物和crRNA的篩選：使用3對(duì)引物分別對(duì)10 3拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行RAA擴(kuò)增，通過(guò)觀察CRISPR-Cas13a檢測(cè)的熒光信號(hào)值篩選擴(kuò)增效率最高的RAA引物。10 3拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒分別使用crRNA1、crRNA2和crRNA3進(jìn)行CRISPR-Cas13a檢測(cè)，觀察反應(yīng)結(jié)束時(shí)（60 min）的熒光強(qiáng)度，篩選檢測(cè)效率最高的crRNA做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
8. RAA 擴(kuò)增：RAA核酸擴(kuò)增試劑盒反應(yīng)總體積為50 μl，其中上游引物（10 mmol/L）、下游引物（10 mmol/L）和 MgCl 2各2 μl，DNA 模板5 μl。反應(yīng)條件為 37 ℃ 30 min，陰性對(duì)照為無(wú)酶無(wú)菌水。
9. CRISPR-Cas13a檢測(cè)：CRISPR-Cas13a檢測(cè)體系包括：NTP混合物（2.5 mmol/L）2 μl，LwCas13a蛋白（25 nmol/L）1 μl，RNA酶抑制劑1 μl，T7 RNA聚合酶0.5 μl，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（20 mmol/L）0.5 μl，MgCl 2溶液（10 mmol/L）0.25 μl，crRNA（2 μmol/L）1.5 μl，熒光報(bào)告RNA（2 nmol/L）2.5 μl，無(wú)酶無(wú)菌水（ddH 2O）10.75 μl，擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，總體積25 μl。其中crRNA序列為：GGGGAU UUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUACGAACCACUGAACAAAUGGCACUAGU，反應(yīng)條件為 37 ℃ 1 h，陰性對(duì)照為無(wú)酶無(wú)菌水。
10.靈敏度評(píng)價(jià)：使用梯度稀釋HBV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（初始濃度為1×10 6 IU/ml，稀釋為1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0和1×10 -1 IU/ml）和HBV陽(yáng)性臨床樣本（1×10 6、1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0 IU/ml和未檢測(cè)到HBV DNA）作為檢測(cè)模板，利用已建立的CRISPR-Cas13a檢測(cè)方法在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次運(yùn)行2個(gè)重復(fù)（復(fù)孔）。
11.特異性評(píng)價(jià)：為評(píng)價(jià)CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測(cè)HBV DNA的特異性，本研究收集了其他常見(jiàn)的傳染性疾病的陽(yáng)性臨床樣本各6例（HDV、HEV和HIV），提取總RNA后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)后的擴(kuò)增產(chǎn)物作為檢測(cè)模板進(jìn)行交叉反應(yīng)。該試驗(yàn)在不同的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，每次運(yùn)行2個(gè)重復(fù)。
12. qPCR檢測(cè)：使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒對(duì)不同病毒載量的HBV DNA陽(yáng)性患者樣本進(jìn)行qPCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min熱變性；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃自動(dòng)延伸10 min。根據(jù)Ct值判斷結(jié)果：Ct值≤35為陽(yáng)性，35<Ct值<40需重新檢測(cè)確認(rèn)，Ct值無(wú)結(jié)果或>40為陰性。
13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用GraphPad prism 8.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量采用表示，多組間的比較采用方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)，2組間的比較采用配對(duì) t檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
一、RAA引物和crRNA篩選瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了9組RAA引物（F1、F2、F3和R1、R2、R3排列組合）的可用性和擴(kuò)增效率。根據(jù)亮度結(jié)果（ 圖1 ），HBV-RAA-F2、HBV-RAA-R2配對(duì)的RAA引物對(duì)表現(xiàn)出最佳的擴(kuò)增效率（17 602.2±1 437.2），與陰性對(duì)照（5 791.64±472.8）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=11.04， P<0.01）。crRNA1、crRNA2和crRNA3的熒光強(qiáng)度分別為200.7±9.9、181.1±8.8和229.0±4.3，其中crRNA3的熒光值均高于crRNA1（ t=4.536， P<0.01）和crRNA2（ t=8.479， P<0.01），使用crRNA3用于后續(xù)檢測(cè)（ 圖2 ）。
二、靈敏度和特異性的評(píng)價(jià)使用CRISPR-Cas13a檢測(cè)60 min時(shí)，1×10 0 IU/ml的HBV DNA熒光強(qiáng)度（23.7±11.5）與陰性對(duì)照（1.8±0.3）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=47.96， P<0.01）（ 圖3A ）。反應(yīng)進(jìn)行 60 min 時(shí)，HBV陽(yáng)性患者樣本的檢測(cè)相對(duì)熒光值與陰性對(duì)照的熒光值分別為196.3±7.6和4.8±1.1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ t=13.63， P<0.01）。HIV、HEV、HDV陽(yáng)性患者樣本的檢測(cè)熒光值分別為5.4±1.5、4.9±1.6和5.0±1.0，與陰性對(duì)照的熒光值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P>0.05， 圖3B ）。因此，該法檢測(cè)HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度可達(dá)到1×10 0 IU/ml。
實(shí)驗(yàn)討論：
本研究將RAA與CRISPR檢測(cè)相結(jié)合建立了RAA-CRISPR 的精準(zhǔn)檢測(cè)HBV DNA的方法，建立的檢測(cè)方法對(duì)HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)靈敏度為1 IU/ml；對(duì) HBV DNA 陽(yáng)性樣本的檢測(cè)靈敏度也達(dá)到<10 IU/ml。本研究還對(duì)70 個(gè)HBV DNA陽(yáng)性臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，CRISPR-Cas13a 檢測(cè) HBV DNA的陽(yáng)性率為 100%（70/70）。與qPCR檢測(cè)系統(tǒng)比較，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)能更快地檢測(cè)出HBV DNA陽(yáng)性患者。本研究建立的檢測(cè)方法可以快速精準(zhǔn)地檢測(cè)HBV DNA，但也存在一些不足之處。由于 CRISPR系統(tǒng)的“附帶切割”具有非特異性，即切割持續(xù)且隨機(jī)，因此對(duì)HBV DNA只能進(jìn)行定性檢測(cè)，無(wú)法定量分析。本研究將RAA快速擴(kuò)增與CRISPR-Cas13a相結(jié)合檢測(cè)HBV DNA，靈敏度高、特異性好。該方法還有望替代目前基于qPCR的 HBV DNA診斷方法，降低HBV檢測(cè)成本且有助于臨床HBV患者的早期干預(yù)，推動(dòng)乙型肝炎的診斷和管理，為未來(lái)HBV的POCT檢測(cè)提供方向。