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深度解析基于Cas12/13蛋白反式切割活性的即時檢測技術

一、CRISPR-Cas系統(tǒng)的反式切割活性:分子診斷的核心驅(qū)動力  

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為原核生物的適應性免疫系統(tǒng),其第2類系統(tǒng)(如Cas12、Cas13蛋白)通過向?qū)NA(gRNA)識別靶標核酸后,會激活非特異性的“反式切割活性”,即對周圍單鏈核酸(ssDNA或RNA)進行無差別切割。這一特性被巧妙轉(zhuǎn)化為分子診斷工具:通過設計攜帶熒光淬滅基團或顯色基團的報告探針,靶標核酸的存在會觸發(fā)Cas蛋白切割探針,釋放可檢測信號(如熒光、顏色變化),從而實現(xiàn)從核酸識別到信號轉(zhuǎn)換的高效耦合。 

與傳統(tǒng)分子診斷技術(如PCR)相比,基于反式切割活性的檢測方法具有三大核心優(yōu)勢: 

1. 高特異性:gRNA的靶向識別機制確保了單堿基錯配的分辨能力; 

2. 免復雜設備:等溫擴增(如LAMP、RPA)與Cas蛋白反應可在單一溫度下完成,無需熱循環(huán)儀; 

3. 信號放大潛力:單個Cas蛋白分子可切割多個探針分子,實現(xiàn)信號的指數(shù)級放大,顯著提升檢測靈敏度(檢測限可達attomolar級別)。 

二、CRISPR-Cas技術與側(cè)向流動試紙:可視化POCT的主流平臺  

側(cè)向流動試紙(LFD)因操作簡便、成本低、結(jié)果可視化,成為CRISPR-Cas技術在POCT中最成熟的應用形式。其核心原理是將Cas蛋白反應與試紙條的層析顯色結(jié)合:靶標核酸經(jīng)等溫擴增后激活Cas12/13的反式切割活性,切割帶有生物素或熒光標記的探針,釋放的產(chǎn)物與試紙條上的捕獲探針結(jié)合,形成肉眼可見的條帶。 

1. 關鍵技術與代表性系統(tǒng)  

SHERLOCK/DETECTR系統(tǒng):早期經(jīng)典平臺,前者利用Cas13檢測RNA,后者利用Cas12檢測DNA,均通過熒光信號讀取,但需配套儀器。后續(xù)改進版本引入側(cè)向流動試紙,實現(xiàn)無儀器肉眼判讀。 

多重檢測技術:如正交CRISPR-Cas系統(tǒng)(OC-MLFA),通過Cas12a與Cas13a的切割偏好差異,在單條試紙實現(xiàn)多個靶標獨立顯色,避免信號干擾(如Su等檢測SARS-CoV-2不同變異株)。 

適配體與納米技術整合:Zhuang等將Cas12a與表面增強拉曼光譜(SERS)結(jié)合,在微流控紙基裝置上實現(xiàn)鼠傷寒沙門菌的超靈敏檢測,檢測限低至10 CFU/mL。 

2. 應用領域拓展  

病原體檢測:從病毒(如新冠病毒、HPV)到細菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、寄生蟲(如瘧原蟲、弓形蟲),覆蓋感染性疾病的快速診斷。例如,Wei等的RPA-Cas12a平臺通過試紙條直接檢測惡性瘧原蟲,無需核酸提取步驟,15分鐘內(nèi)出結(jié)果。 

非核酸小分子檢測:Jiang等開發(fā)的Bio-SCAN V2系統(tǒng),利用配體響應性crRNA結(jié)合dCas9-生物素,將小分子(如茶堿)的檢測轉(zhuǎn)化為試紙條顯色,檢測限達2 μmol/L。 

3. 挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向  

穩(wěn)定性問題:試紙條在高溫高濕環(huán)境下易失效,需優(yōu)化凍干工藝和保存條件(如添加穩(wěn)定劑)。 

多重檢測瓶頸:試紙條空間有限,多靶標檢測時易出現(xiàn)交叉反應,需通過正交Cas蛋白或空間分隔設計提升兼容性。 

定量精度不足:肉眼判讀依賴經(jīng)驗,需引入智能手機圖像分析或色度計實現(xiàn)半定量。 

三、比色法:基于納米材料的可視化信號放大  

比色法通過設計Cas蛋白切割觸發(fā)納米顆粒(如金納米顆粒AuNPs、氧化石墨烯GO)的聚集或分散,導致溶液顏色變化,實現(xiàn)肉眼可見的檢測。其核心優(yōu)勢是無需儀器、成本極低,適合資源匱乏地區(qū)。 

1. 核心機制與納米探針設計  

AuNPs聚集顯色:未切割時,AuNPs表面修飾的DNA探針互補結(jié)合,保持分散(紅色);Cas蛋白切割后,探針釋放,AuNPs聚集為藍色,顏色變化與靶標濃度正相關(如Yuan等檢測沙門菌)。 

G-四鏈體/酶催化反應:Chen等將Cas12a與G-四鏈體DNA酶結(jié)合,切割后釋放G-四鏈體激活辣根過氧化物酶(HRP),催化底物顯色,檢測副溶血性弧菌的檢測限低至3×10³ CFU/mL。 

2. 多樣化應用場景  

病毒與癌癥檢測:Gong等利用鏈置換擴增(SDA)聯(lián)合Cas12a,通過AuNPs比色法檢測乙肝病毒DNA,肉眼可分辨10?拷貝/mL;Feng等將Cas12a與滾環(huán)擴增(RCA)結(jié)合,檢測肺癌標志物EGFR 19del突變,30分鐘內(nèi)完成。 

食品安全與遺傳病:Chen等開發(fā)Cas14a介導的比色法檢測黃曲霉毒素B1,結(jié)合磁性納米顆粒分離靶標,檢測限達0.1 ng/mL;Choi等利用AuNP輔助熒光增強,無需擴增直接檢測BRCA-1基因突變,30分鐘內(nèi)完成循環(huán)游離DNA分析。 

3. 技術瓶頸與突破方向  

環(huán)境干擾:光線強度、觀察者主觀差異影響顏色判讀,需建立標準化比色卡或引入智能手機光譜分析算法(如Xie等的MagicEye軟件)。 

靈敏度限制:依賴納米顆粒的物理化學性質(zhì),需結(jié)合等溫擴增(如RPA、LAMP)進一步提升信號放大效率。 

四、微流控技術:集成化與自動化的前沿陣地  

微流控芯片通過微米級通道整合核酸提取、擴增、Cas蛋白反應及信號檢測,實現(xiàn)“樣本進-結(jié)果出”的全流程自動化,是POCT向高通量、多參數(shù)檢測發(fā)展的關鍵平臺。 

1. 核心優(yōu)勢與技術整合  

多步驟一體化:Qin等的微流控芯片集成RT-LAMP擴增與Cas13a檢測,5分鐘內(nèi)完成埃博拉病毒RNA檢測,檢測限5.45×10?拷貝/mL,體積僅硬幣大小。 

電化學與熒光檢測結(jié)合:Najjar等開發(fā)的芯片同時檢測新冠病毒RNA(Cas13a熒光信號)和宿主抗體(ELISA電化學信號),通過LAMP預擴增提升靈敏度,適合疫情現(xiàn)場的雙指標監(jiān)測。 

2. 代表性應用案例  

HIV即時檢測:Huang等的“差異表達”芯片利用磁流體驅(qū)動樣本轉(zhuǎn)移,避免氣溶膠污染,配套便攜式加熱裝置,結(jié)果可通過手機APP讀取,檢測窗口期縮短至感染后2周。 

多重耐藥菌檢測:Dai等的單管RPA-Cas12a系統(tǒng)集成到手掌大小反應器中,通過便攜式陣列檢測器分析幽門螺桿菌保守基因,15分鐘內(nèi)完成從樣本到結(jié)果的全流程。 

3. 挑戰(zhàn)與未來方向  

成本與量產(chǎn):芯片制造依賴光刻技術,單價較高(約10-20美元/片),需開發(fā)低成本材料(如紙基、PDMS)和簡化工藝流程。 

樣本前處理:復雜生物樣本(如血清、糞便)需高效純化,需集成微型濾膜或磁珠分離模塊,提升抗干擾能力。 

五、智能手機與便攜式設備:構(gòu)建個性化檢測網(wǎng)絡  

智能手機的普及推動了POCT的“平民化”,通過攝像頭成像、光譜分析或定制APP,將手機轉(zhuǎn)化為便攜式檢測儀;而專用設備(如血糖儀、3D打印可視化器)則進一步拓展了檢測場景。 

1. 智能手機輔助檢測  

圖像識別算法:Zheng等開發(fā)的HPV分型檢測平臺,設計便攜式熒光成像模塊,手機拍照后通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(CNN)分析條帶強度,定量精度達95%以上。 

化學發(fā)光與比色結(jié)合:Chen等的G4CLCas平臺利用手機成像盒捕獲化學發(fā)光信號,檢測核酸和非核酸靶標(如心肌肌鈣蛋白I),檢測限低至10?¹² mol/L,適合床旁急診檢測。 

2. 專用便攜式設備  

血糖儀改造:Huang等將Cas12a反應與葡萄糖氧化酶偶聯(lián),將病毒核酸信號轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度變化,利用商用血糖儀讀取,實現(xiàn)新冠病毒的定量檢測,檢測范圍10²-10?拷貝/mL。 

3D打印可視化器:Ma等開發(fā)的便攜式裝置結(jié)合CRISPR-Cas12a與上轉(zhuǎn)換熒光粉,非專業(yè)人員可通過手機APP分析熒光信號,檢測小分子污染物(如卡那霉素),檢測限達1 pmol/L。 

3. 技術難點與優(yōu)化策略  

硬件標準化:不同手機攝像頭靈敏度差異導致結(jié)果偏差,需開發(fā)通用型光學適配器(如濾光片、微距鏡頭)。 

數(shù)據(jù)管理與傳輸:檢測結(jié)果的云端存儲與實時共享需解決隱私保護問題,可引入?yún)^(qū)塊鏈技術確保數(shù)據(jù)安全。 

六、總結(jié)與展望:從實驗室到臨床的轉(zhuǎn)化之路  

CRISPR-Cas系統(tǒng)憑借反式切割活性,已從基因編輯工具轉(zhuǎn)型為分子診斷的“萬能平臺”,在POCT中展現(xiàn)出三大核心價值: 

1. 技術通用性:同一套Cas蛋白框架可適配核酸、蛋白、小分子等多種靶標,僅需更換gRNA和報告探針; 

2. 場景兼容性:從基層醫(yī)療(如瘧疾快速檢測)到疫情防控(如新冠病毒分型)、食品安全(如沙門菌篩查),覆蓋全場景檢測需求; 

3. 成本效益比:單測試劑成本可控制在1-5美元,遠低于傳統(tǒng)分子診斷(如qPCR約10-30美元)。 

然而,技術轉(zhuǎn)化仍面臨多重挑戰(zhàn): 

標準化體系缺失:不同平臺的檢測限、特異性差異較大,需建立統(tǒng)一的性能評價標準(如WHO體外診斷試劑基準); 

非核酸檢測瓶頸:針對蛋白、代謝物等靶標,需開發(fā)高效的信號轉(zhuǎn)換模塊(如適配體Cas蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)); 

監(jiān)管與倫理:便攜式設備的居家使用可能引發(fā)檢測結(jié)果誤判,需配套患者教育體系和遠程醫(yī)療支持。 

未來發(fā)展方向?qū)⒕劢褂冢?/span> 

1. 多技術融合:微流控芯片整合CRISPR-Cas與AI圖像分析,實現(xiàn)全自動、高通量檢測; 

2. 材料創(chuàng)新:開發(fā)可降解紙基芯片、凍干型Cas蛋白試劑,提升設備便攜性和存儲穩(wěn)定性; 

3. 診療一體化:結(jié)合CRISPR的基因編輯功能,構(gòu)建“檢測-干預”閉環(huán)(如現(xiàn)場檢測耐藥基因后精準用藥)。 

隨著技術迭代與監(jiān)管完善,基于CRISPR-Cas的POCT有望成為精準醫(yī)療的“最后一公里”解決方案,為全球傳染病防控、癌癥早篩和個性化醫(yī)療提供普惠性技術支撐。 

 相關產(chǎn)品:RPA試劑盒及試紙條系列:

貨號

產(chǎn)品

規(guī)格

B8201C1

DNA恒溫快速擴增試劑盒(DNA基礎型)

48T

B8202C3

DNA恒溫快速擴增試劑盒(DNA熒光型)

48T

B8203C5

DNA恒溫快速擴增試劑盒(DNA試紙條型)

48T

B8204C7

RNA恒溫快速擴增試劑盒(RNA基礎型)

48T

B8205C9

RNA恒溫快速擴增試劑盒(RNA熒光型)

48T

B8206C0

RNA恒溫快速擴增試劑盒(RNA試紙條型)

48T

JY0209

雙靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0201

單靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0307

CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

CRISPR雙酶切檢測試紙條(變色龍)

50T

 

Cas酶系列

貨號

包裝規(guī)格

中文名稱

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32101-01

100 pmoL

SpCas9

32101-03

1,000 pmoL

SpCas9

32102-01

100 pmoL

Sp-dCas9

32102-03

1,000 pmoL

Sp-dCas9

32120-01

100 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

32120-03

1,000 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

 
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