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一、CRISPR-Cas系統(tǒng)的反式切割活性:分子診斷的核心驅(qū)動(dòng)力
CRISPR-Cas系統(tǒng)作為原核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),其第2類系統(tǒng)(如Cas12、Cas13蛋白)通過向?qū)NA(gRNA)識(shí)別靶標(biāo)核酸后,會(huì)激活非特異性的“反式切割活性”,即對(duì)周圍單鏈核酸(ssDNA或RNA)進(jìn)行無差別切割。這一特性被巧妙轉(zhuǎn)化為分子診斷工具:通過設(shè)計(jì)攜帶熒光淬滅基團(tuán)或顯色基團(tuán)的報(bào)告探針,靶標(biāo)核酸的存在會(huì)觸發(fā)Cas蛋白切割探針,釋放可檢測(cè)信號(hào)(如熒光、顏色變化),從而實(shí)現(xiàn)從核酸識(shí)別到信號(hào)轉(zhuǎn)換的高效耦合。
與傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)(如PCR)相比,基于反式切割活性的檢測(cè)方法具有三大核心優(yōu)勢(shì):
1. 高特異性:gRNA的靶向識(shí)別機(jī)制確保了單堿基錯(cuò)配的分辨能力;
2. 免復(fù)雜設(shè)備:等溫?cái)U(kuò)增(如LAMP、RPA)與Cas蛋白反應(yīng)可在單一溫度下完成,無需熱循環(huán)儀;
3. 信號(hào)放大潛力:單個(gè)Cas蛋白分子可切割多個(gè)探針分子,實(shí)現(xiàn)信號(hào)的指數(shù)級(jí)放大,顯著提升檢測(cè)靈敏度(檢測(cè)限可達(dá)attomolar級(jí)別)。
二、CRISPR-Cas技術(shù)與側(cè)向流動(dòng)試紙:可視化POCT的主流平臺(tái)
側(cè)向流動(dòng)試紙(LFD)因操作簡(jiǎn)便、成本低、結(jié)果可視化,成為CRISPR-Cas技術(shù)在POCT中最成熟的應(yīng)用形式。其核心原理是將Cas蛋白反應(yīng)與試紙條的層析顯色結(jié)合:靶標(biāo)核酸經(jīng)等溫?cái)U(kuò)增后激活Cas12/13的反式切割活性,切割帶有生物素或熒光標(biāo)記的探針,釋放的產(chǎn)物與試紙條上的捕獲探針結(jié)合,形成肉眼可見的條帶。
1. 關(guān)鍵技術(shù)與代表性系統(tǒng)
SHERLOCK/DETECTR系統(tǒng):早期經(jīng)典平臺(tái),前者利用Cas13檢測(cè)RNA,后者利用Cas12檢測(cè)DNA,均通過熒光信號(hào)讀取,但需配套儀器。后續(xù)改進(jìn)版本引入側(cè)向流動(dòng)試紙,實(shí)現(xiàn)無儀器肉眼判讀。
多重檢測(cè)技術(shù):如正交CRISPR-Cas系統(tǒng)(OC-MLFA),通過Cas12a與Cas13a的切割偏好差異,在單條試紙實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)獨(dú)立顯色,避免信號(hào)干擾(如Su等檢測(cè)SARS-CoV-2不同變異株)。
適配體與納米技術(shù)整合:Zhuang等將Cas12a與表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)結(jié)合,在微流控紙基裝置上實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌的超靈敏檢測(cè),檢測(cè)限低至10 CFU/mL。
2. 應(yīng)用領(lǐng)域拓展
病原體檢測(cè):從病毒(如新冠病毒、HPV)到細(xì)菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、寄生蟲(如瘧原蟲、弓形蟲),覆蓋感染性疾病的快速診斷。例如,Wei等的RPA-Cas12a平臺(tái)通過試紙條直接檢測(cè)惡性瘧原蟲,無需核酸提取步驟,15分鐘內(nèi)出結(jié)果。
非核酸小分子檢測(cè):Jiang等開發(fā)的Bio-SCAN V2系統(tǒng),利用配體響應(yīng)性crRNA結(jié)合dCas9-生物素,將小分子(如茶堿)的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為試紙條顯色,檢測(cè)限達(dá)2 μmol/L。
3. 挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向
穩(wěn)定性問題:試紙條在高溫高濕環(huán)境下易失效,需優(yōu)化凍干工藝和保存條件(如添加穩(wěn)定劑)。
多重檢測(cè)瓶頸:試紙條空間有限,多靶標(biāo)檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)交叉反應(yīng),需通過正交Cas蛋白或空間分隔設(shè)計(jì)提升兼容性。
定量精度不足:肉眼判讀依賴經(jīng)驗(yàn),需引入智能手機(jī)圖像分析或色度計(jì)實(shí)現(xiàn)半定量。
三、比色法:基于納米材料的可視化信號(hào)放大
比色法通過設(shè)計(jì)Cas蛋白切割觸發(fā)納米顆粒(如金納米顆粒AuNPs、氧化石墨烯GO)的聚集或分散,導(dǎo)致溶液顏色變化,實(shí)現(xiàn)肉眼可見的檢測(cè)。其核心優(yōu)勢(shì)是無需儀器、成本極低,適合資源匱乏地區(qū)。
1. 核心機(jī)制與納米探針設(shè)計(jì)
AuNPs聚集顯色:未切割時(shí),AuNPs表面修飾的DNA探針互補(bǔ)結(jié)合,保持分散(紅色);Cas蛋白切割后,探針釋放,AuNPs聚集為藍(lán)色,顏色變化與靶標(biāo)濃度正相關(guān)(如Yuan等檢測(cè)沙門菌)。
G-四鏈體/酶催化反應(yīng):Chen等將Cas12a與G-四鏈體DNA酶結(jié)合,切割后釋放G-四鏈體激活辣根過氧化物酶(HRP),催化底物顯色,檢測(cè)副溶血性弧菌的檢測(cè)限低至3×10³ CFU/mL。
2. 多樣化應(yīng)用場(chǎng)景
病毒與癌癥檢測(cè):Gong等利用鏈置換擴(kuò)增(SDA)聯(lián)合Cas12a,通過AuNPs比色法檢測(cè)乙肝病毒DNA,肉眼可分辨10?拷貝/mL;Feng等將Cas12a與滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)結(jié)合,檢測(cè)肺癌標(biāo)志物EGFR 19del突變,30分鐘內(nèi)完成。
食品安全與遺傳病:Chen等開發(fā)Cas14a介導(dǎo)的比色法檢測(cè)黃曲霉毒素B1,結(jié)合磁性納米顆粒分離靶標(biāo),檢測(cè)限達(dá)0.1 ng/mL;Choi等利用AuNP輔助熒光增強(qiáng),無需擴(kuò)增直接檢測(cè)BRCA-1基因突變,30分鐘內(nèi)完成循環(huán)游離DNA分析。
3. 技術(shù)瓶頸與突破方向
環(huán)境干擾:光線強(qiáng)度、觀察者主觀差異影響顏色判讀,需建立標(biāo)準(zhǔn)化比色卡或引入智能手機(jī)光譜分析算法(如Xie等的MagicEye軟件)。
靈敏度限制:依賴納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì),需結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增(如RPA、LAMP)進(jìn)一步提升信號(hào)放大效率。
四、微流控技術(shù):集成化與自動(dòng)化的前沿陣地
微流控芯片通過微米級(jí)通道整合核酸提取、擴(kuò)增、Cas蛋白反應(yīng)及信號(hào)檢測(cè),實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的全流程自動(dòng)化,是POCT向高通量、多參數(shù)檢測(cè)發(fā)展的關(guān)鍵平臺(tái)。
1. 核心優(yōu)勢(shì)與技術(shù)整合
多步驟一體化:Qin等的微流控芯片集成RT-LAMP擴(kuò)增與Cas13a檢測(cè),5分鐘內(nèi)完成埃博拉病毒RNA檢測(cè),檢測(cè)限5.45×10?拷貝/mL,體積僅硬幣大小。
電化學(xué)與熒光檢測(cè)結(jié)合:Najjar等開發(fā)的芯片同時(shí)檢測(cè)新冠病毒RNA(Cas13a熒光信號(hào))和宿主抗體(ELISA電化學(xué)信號(hào)),通過LAMP預(yù)擴(kuò)增提升靈敏度,適合疫情現(xiàn)場(chǎng)的雙指標(biāo)監(jiān)測(cè)。
2. 代表性應(yīng)用案例
HIV即時(shí)檢測(cè):Huang等的“差異表達(dá)”芯片利用磁流體驅(qū)動(dòng)樣本轉(zhuǎn)移,避免氣溶膠污染,配套便攜式加熱裝置,結(jié)果可通過手機(jī)APP讀取,檢測(cè)窗口期縮短至感染后2周。
多重耐藥菌檢測(cè):Dai等的單管RPA-Cas12a系統(tǒng)集成到手掌大小反應(yīng)器中,通過便攜式陣列檢測(cè)器分析幽門螺桿菌保守基因,15分鐘內(nèi)完成從樣本到結(jié)果的全流程。
3. 挑戰(zhàn)與未來方向
成本與量產(chǎn):芯片制造依賴光刻技術(shù),單價(jià)較高(約10-20美元/片),需開發(fā)低成本材料(如紙基、PDMS)和簡(jiǎn)化工藝流程。
樣本前處理:復(fù)雜生物樣本(如血清、糞便)需高效純化,需集成微型濾膜或磁珠分離模塊,提升抗干擾能力。
五、智能手機(jī)與便攜式設(shè)備:構(gòu)建個(gè)性化檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)
智能手機(jī)的普及推動(dòng)了POCT的“平民化”,通過攝像頭成像、光譜分析或定制APP,將手機(jī)轉(zhuǎn)化為便攜式檢測(cè)儀;而專用設(shè)備(如血糖儀、3D打印可視化器)則進(jìn)一步拓展了檢測(cè)場(chǎng)景。
1. 智能手機(jī)輔助檢測(cè)
圖像識(shí)別算法:Zheng等開發(fā)的HPV分型檢測(cè)平臺(tái),設(shè)計(jì)便攜式熒光成像模塊,手機(jī)拍照后通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(CNN)分析條帶強(qiáng)度,定量精度達(dá)95%以上。
化學(xué)發(fā)光與比色結(jié)合:Chen等的G4CLCas平臺(tái)利用手機(jī)成像盒捕獲化學(xué)發(fā)光信號(hào),檢測(cè)核酸和非核酸靶標(biāo)(如心肌肌鈣蛋白I),檢測(cè)限低至10?¹² mol/L,適合床旁急診檢測(cè)。
2. 專用便攜式設(shè)備
血糖儀改造:Huang等將Cas12a反應(yīng)與葡萄糖氧化酶偶聯(lián),將病毒核酸信號(hào)轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度變化,利用商用血糖儀讀取,實(shí)現(xiàn)新冠病毒的定量檢測(cè),檢測(cè)范圍10²-10?拷貝/mL。
3D打印可視化器:Ma等開發(fā)的便攜式裝置結(jié)合CRISPR-Cas12a與上轉(zhuǎn)換熒光粉,非專業(yè)人員可通過手機(jī)APP分析熒光信號(hào),檢測(cè)小分子污染物(如卡那霉素),檢測(cè)限達(dá)1 pmol/L。
3. 技術(shù)難點(diǎn)與優(yōu)化策略
硬件標(biāo)準(zhǔn)化:不同手機(jī)攝像頭靈敏度差異導(dǎo)致結(jié)果偏差,需開發(fā)通用型光學(xué)適配器(如濾光片、微距鏡頭)。
數(shù)據(jù)管理與傳輸:檢測(cè)結(jié)果的云端存儲(chǔ)與實(shí)時(shí)共享需解決隱私保護(hù)問題,可引入?yún)^(qū)塊鏈技術(shù)確保數(shù)據(jù)安全。
六、總結(jié)與展望:從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化之路
CRISPR-Cas系統(tǒng)憑借反式切割活性,已從基因編輯工具轉(zhuǎn)型為分子診斷的“萬能平臺(tái)”,在POCT中展現(xiàn)出三大核心價(jià)值:
1. 技術(shù)通用性:同一套Cas蛋白框架可適配核酸、蛋白、小分子等多種靶標(biāo),僅需更換gRNA和報(bào)告探針;
2. 場(chǎng)景兼容性:從基層醫(yī)療(如瘧疾快速檢測(cè))到疫情防控(如新冠病毒分型)、食品安全(如沙門菌篩查),覆蓋全場(chǎng)景檢測(cè)需求;
3. 成本效益比:單測(cè)試劑成本可控制在1-5美元,遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)分子診斷(如qPCR約10-30美元)。
然而,技術(shù)轉(zhuǎn)化仍面臨多重挑戰(zhàn):
標(biāo)準(zhǔn)化體系缺失:不同平臺(tái)的檢測(cè)限、特異性差異較大,需建立統(tǒng)一的性能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(如WHO體外診斷試劑基準(zhǔn));
非核酸檢測(cè)瓶頸:針對(duì)蛋白、代謝物等靶標(biāo),需開發(fā)高效的信號(hào)轉(zhuǎn)換模塊(如適配體Cas蛋白偶聯(lián)系統(tǒng));
監(jiān)管與倫理:便攜式設(shè)備的居家使用可能引發(fā)檢測(cè)結(jié)果誤判,需配套患者教育體系和遠(yuǎn)程醫(yī)療支持。
未來發(fā)展方向?qū)⒕劢褂冢?/span>
1. 多技術(shù)融合:微流控芯片整合CRISPR-Cas與AI圖像分析,實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)、高通量檢測(cè);
2. 材料創(chuàng)新:開發(fā)可降解紙基芯片、凍干型Cas蛋白試劑,提升設(shè)備便攜性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性;
3. 診療一體化:結(jié)合CRISPR的基因編輯功能,構(gòu)建“檢測(cè)-干預(yù)”閉環(huán)(如現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)耐藥基因后精準(zhǔn)用藥)。
隨著技術(shù)迭代與監(jiān)管完善,基于CRISPR-Cas的POCT有望成為精準(zhǔn)醫(yī)療的“最后一公里”解決方案,為全球傳染病防控、癌癥早篩和個(gè)性化醫(yī)療提供普惠性技術(shù)支撐。
相關(guān)產(chǎn)品:RPA試劑盒及試紙條系列:
貨號(hào) |
產(chǎn)品 |
規(guī)格 |
B8201C1 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(DNA基礎(chǔ)型) |
48T |
B8202C3 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(DNA熒光型) |
48T |
B8203C5 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(DNA試紙條型) |
48T |
B8204C7 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(RNA基礎(chǔ)型) |
48T |
B8205C9 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(RNA熒光型) |
48T |
B8206C0 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(RNA試紙條型) |
48T |
JY0209 |
雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型) |
50T |
JY0201 |
單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型) |
50T |
JY0307 |
CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試紙條 |
50T |
JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
JY0308 |
CRISPR雙酶切檢測(cè)試紙條(變色龍) |
50T
|
Cas酶系列
貨號(hào) |
包裝規(guī)格 |
中文名稱 |
32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
32118-01 |
100 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
32119-01 |
100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
32119-03 |
1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
32104-01 |
100 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
32104-03 |
1,000 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
32116-01 |
100 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
32116-03 |
1,000 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
32106-01 |
100 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
32106-03 |
1,000 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
32110-01 |
100 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
32110-03 |
1,000 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
32101-01 |
100 pmoL |
SpCas9 |
32101-03 |
1,000 pmoL |
SpCas9 |
32102-01 |
100 pmoL |
Sp-dCas9 |
32102-03 |
1,000 pmoL |
Sp-dCas9 |
32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9(H840A) |
32120-03 |
1,000 pmoL |
Sp-nCas9(H840A) |