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解析文章：《Conservation of an immune homeostasis module in land plants》 

作者：Ruoqi Dou ¹ , Karima El Mahboubi ² , Cailun A.S. Tanney ¹ , Jiashu Chu ^3,a , Melissa Bredow ¹ , Maria Camila Rodriguez Gallo 4 , Dominique Lauressergues ² , Jean Keller ² , Virginia Natali Miguel ¹ , Thomas A. DeFalco ^{3,b , R}. Glen Uhrig ^4,5 , Cyril Zipfel ³, Pierre-Marc Delaux ² , and Jacqueline Monaghan ^1,* 

鏈接：https://www.bioz.com/articles/showDocs/?q=bio_rxiv__2024__10__01__616128&uq=*&v=&k=1dS238k0216N820MIp01&ix=45ad23

 

背景

該文章探討了植物中CPK28-PUB25/26-BIK1模塊的保守性及其在植物免疫穩(wěn)態(tài)中的作用。CPK28是一種鈣依賴型蛋白激酶，已知在多種植物中調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)和生長發(fā)育。文章特別關(guān)注了在陸生植物中，該模塊如何進(jìn)化并保守地調(diào)控植物的免疫反應(yīng)。

 

方法

植物材料：

擬南芥：用于功能互補實驗，檢測MPCPK28在擬南芥中的功能。

地錢（Marchantia polymorpha）：作為非血管植物的模型，研究CPK28及其相關(guān)蛋白的進(jìn)化和功能。

煙草（Nicotiana benthamiana）：用于蛋白亞細(xì)胞定位的瞬時表達(dá)實驗。

 

基因克隆與表達(dá)：

通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建各種表達(dá)載體，包括MPCPK28、MPPBLa、MPPUB20e等基因的過表達(dá)載體。使用Golden Gate、Gateway、In-Fusion、Gibson Assembly等多種克隆方法。

 

蛋白純化與體外激酶實驗：

從大腸桿菌中純化帶有His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的重組蛋白。使用Tymora Analytical品牌的pIMAGO HRP Detection on Western Blot試劑盒（貨號：800-40）檢測激酶活性。

 

細(xì)胞降解實驗與泛素化實驗：

在體外進(jìn)行細(xì)胞降解實驗，檢測MPPBLa和AtBIK1的蛋白降解情況。進(jìn)行泛素化實驗，驗證MPPUB20e對MPPBLa的泛素化作用。

 

磷酸化蛋白組學(xué)分析：

對地錢蛋白提取物進(jìn)行磷酸化蛋白組學(xué)分析，鑒定MPCPK28的磷酸化底物。

 

植物表型分析：

觀察MPCPK28過表達(dá)地錢植株的表型變化，包括生長發(fā)育和免疫反應(yīng)。

在擬南芥中進(jìn)行互補實驗，觀察MPCPK28對cpk28-1突變體表型的恢復(fù)作用。

 

實驗介紹 - Tymora Analytical品牌的pIMAGO HRP Detection on Western Blot試劑盒

產(chǎn)品作用：

Tymora Analytical品牌的pIMAGO HRP Detection on Western Blot試劑盒（貨號：800-40）是一種用于Western Blot檢測的高靈敏度試劑盒。它結(jié)合了酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）的高靈敏度和傳統(tǒng)Western Blot的特異性，能夠檢測低豐度蛋白的磷酸化狀態(tài)。該試劑盒特別適用于檢測激酶活性實驗中的磷酸化底物，能夠清晰、準(zhǔn)確地顯示蛋白的磷酸化水平。

 

高靈敏度：

pIMAGO試劑盒采用先進(jìn)的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，能夠在低豐度蛋白存在的情況下提供清晰的信號，使得激酶活性檢測更加準(zhǔn)確可靠。在研究低豐度或短壽命的磷酸化蛋白時，pIMAGO試劑盒能夠顯著提高檢測靈敏度，避免假陰性結(jié)果。

 

特異性：

試劑盒中的抗體經(jīng)過嚴(yán)格篩選和優(yōu)化，能夠特異性地識別目標(biāo)蛋白的磷酸化位點，減少非特異性結(jié)合帶來的背景干擾。結(jié)合傳統(tǒng)Western Blot的特異性，pIMAGO試劑盒能夠準(zhǔn)確反映蛋白的磷酸化狀態(tài)，為激酶活性研究提供有力支持。

 

操作簡便：

試劑盒提供了完整的操作指南和配套試劑，用戶只需按照指南逐步操作即可完成實驗。

無需復(fù)雜的實驗步驟或昂貴的儀器設(shè)備，適用于各種實驗室環(huán)境。

 

廣泛應(yīng)用：

pIMAGO試劑盒不僅適用于激酶活性檢測，還可用于其他需要高靈敏度Western Blot檢測的實驗場景。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、癌癥研究等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

 

應(yīng)用：

在本文中，pIMAGO試劑盒被用于檢測MPCPK28的激酶活性及其底物的磷酸化狀態(tài)。通過純化MPCPK28及其底物蛋白（如MPPBLa和MPPUB20e），在體外進(jìn)行激酶反應(yīng)，并使用pIMAGO試劑盒檢測底物的磷酸化水平。實驗結(jié)果表明，MPCPK28能夠磷酸化MPPBLa和MPPUB20e等多個底物，且磷酸化位點在進(jìn)化上高度保守。這些結(jié)果為揭示CPK28-PUB25/26-BIK1模塊在陸生植物中的保守性和功能提供了重要證據(jù)。

 

結(jié)論

文章通過一系列實驗證明了CPK28-PUB25/26-BIK1模塊在陸生植物中的保守性及其在免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的重要作用。主要結(jié)論包括：

MPCPK28的功能保守性：

MPCPK28在地錢中顯示出與擬南芥AtCPK28相似的激酶活性和功能，能夠調(diào)控地錢的免疫穩(wěn)態(tài)和生長發(fā)育。

 

底物的磷酸化調(diào)控：

MPCPK28能夠磷酸化多個底物蛋白，包括MPPBLa和MPPUB20e等，這些底物的磷酸化在進(jìn)化上高度保守。

 

模塊的保守性：

CPK28-PUB25/26-BIK1模塊在陸生植物中廣泛存在且功能保守，對于維持植物的免疫穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

 

進(jìn)化意義：

該模塊在陸生植物進(jìn)化過程中可能起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，有助于植物適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境和微生物群落。

 

綜上所述，文章通過深入研究CPK28-PUB25/26-BIK1模塊的保守性和功能，為揭示植物免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機制提供了新的視角和線索。Tymora Analytical品牌的pIMAGO HRP Detection on Western Blot試劑盒在實驗中發(fā)揮了重要作用，為準(zhǔn)確檢測蛋白磷酸化狀態(tài)提供了有力支持。

 

Tymora品牌 pIMAGO?-biotin Phosphoprotein Detection Kit

For Western Blot HRP-based detection(ECL)

貨號：800-40 無需抗體的磷酸化蛋白檢測試劑盒

 

pIMAGO是一種通用的磷酸化蛋白檢測技術(shù)，能夠?qū)α姿峄肿舆M(jìn)行敏感和特異性的識別。與磷酸化抗體不同，該結(jié)合不受氨基酸序列的影響，因此可用于檢測任何蛋白質(zhì)位點上的任何磷酸化發(fā)生。pIMAGO檢測方案類似于一個簡單的Western Blot，簡單、便捷、高效。