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建立靈敏、快速的RPA檢測，依賴于合適擴(kuò)增引物的選擇。由于目前還不能完全根據(jù)引物的序列特征來預(yù)測其擴(kuò)增性能，建議通過實(shí)驗(yàn)的方式來篩選一些列候選引物來確定最優(yōu)引物對。

Note：對于檢測要求不高的實(shí)驗(yàn)（模板超過1000個(gè)拷貝），大多數(shù)情況下只需要進(jìn)行少量篩選，即可找到合適引物對，甚至使用PCR引物就足以用于反應(yīng)。對于高靈敏度分析，建議按照以下設(shè)計(jì)方案進(jìn)行篩選。

1.     靶序列的選擇

如果是用于檢測臨床樣本，那么合適的靶序列，一定是盡可能保守的。雖然RPA技術(shù)對引物和模板之間的匹配要求不是那么嚴(yán)謹(jǐn)，但是過多不匹配的堿基，必然會(huì)影響擴(kuò)增的效率，從而使得準(zhǔn)確率和靈敏度下降。

2.     引物長度

為PCR設(shè)計(jì)的引物通?？梢杂糜赗PA反應(yīng)，但擴(kuò)增效率可能不高。RPA引物的理想長度為30~35bp，比典型的PCR引物長。不同于PCR反應(yīng)，RPA反應(yīng)的過程不依賴于溫度變化，因此引物的Tm值和RPA反應(yīng)擴(kuò)增效率之間沒有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。相反，許多RPA引物也可用于PCR擴(kuò)增，但它們在PCR中的擴(kuò)增性能可能與其作為RPA引物的擴(kuò)增性能沒有直接關(guān)系。

短于30bp的引物仍然可以用于RPA反應(yīng)。然而，與>30bp的引物相比，其擴(kuò)增效率通常更低。對于大于35bp的引物，其依然有可能獲得很好的擴(kuò)增性能。但是引物越長，其形成引物二聚體的可能性越大，反而影響特異產(chǎn)物的擴(kuò)增效率。因此，不建議設(shè)計(jì)過長的引物。

3.     引物序列

引物的序列直接的影響著RPA反應(yīng)的擴(kuò)增效率，目前還不能完全根據(jù)引物的序列來預(yù)測其擴(kuò)增性能。雖然有一些根據(jù)經(jīng)驗(yàn)觀察而建立的指南，但這并不能替代實(shí)驗(yàn)的方式來檢驗(yàn)引物的實(shí)際效率。

在大多數(shù)的情況下，最好避免引物中特殊的序列結(jié)構(gòu)，例如某個(gè)特定連續(xù)的核苷酸或大量的短重復(fù)。GC含量過高(>70%)或過低(<30%)可能不利于反應(yīng)。另外，盡量避免可在引物內(nèi)部或者引物引物之間形成引物二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列。

         4.     擴(kuò)增產(chǎn)物長度

Note：引物噪音即擴(kuò)增反應(yīng)中由引物產(chǎn)生的非特異擴(kuò)增。由于引物噪音的影響，RPA中的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小直接影響著擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度和速度。雖然引物的噪音與RPA產(chǎn)物的長度無關(guān)，但更長的RPA產(chǎn)物需要更長的倍增時(shí)間。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物越長，引物噪音的擴(kuò)增越有可能超過目的片段的擴(kuò)增。所以，較短的擴(kuò)增產(chǎn)物對超敏度分析有利。

如果在檢測中使用探針，那么在設(shè)計(jì)RPA擴(kuò)增引物時(shí)必須注意為探針的設(shè)計(jì)留出足夠的序列空間。

5.     引物選擇

引物選擇過程通常包括以下步驟:

1)    目標(biāo)序列的選擇：

建議在模板中選擇一個(gè)區(qū)域，其特征在于相對“平均”的核苷酸序列組成:

l  GC含量在40%和60%之間

l  重復(fù)序列

l  少數(shù)正向/反向重復(fù)，回文

       盡量避免選擇擴(kuò)增模板中的重復(fù)序列以保證目標(biāo)序列的唯一性。在這方面，目標(biāo)序列的選擇與PCR中的選擇原則一致。

2)    候選引物

選擇合適的目標(biāo)區(qū)域后，選擇兩組相互面對(即具有正向和反向)的交錯(cuò)引物作為候選引物。相同方向的引物可以重疊，但不是必須重疊。來自正向組的每條引物可以隨后與來自反向組的每條引物配對。篩選一對可用于檢測單分子DNA模板并且倍增時(shí)間短于20秒（RPA指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物增加一倍所需的時(shí)間）的引物，通常需要每個(gè)方向有8-10條候選引物（也就是說，64-100對引物組合）。

如果對引物的擴(kuò)增效率要求不高(例如：樣品中被檢測的樣本濃度相對較高)，可以在PCR引物設(shè)計(jì)軟件中直接設(shè)定以下參數(shù):

l  引物大小最小30bp，最大36bp

l  引物GC%最低20，最高70

l  引物Tm最低50，最高100

l  單核苷酸重復(fù)的最大允許長度，例如“CCCCC”設(shè)置為5。

3)    引物的篩選

見引物的三級(jí)篩選。

6.     困難的擴(kuò)增

在某些情況下，擴(kuò)增序列內(nèi)部的基序(即引物之間的序列)對快速擴(kuò)增不利，并且只要擴(kuò)增產(chǎn)物中包含了這段序列基序的引物都表現(xiàn)不佳。嘗試為特定的目的區(qū)域設(shè)計(jì)合適的引物，卻始終無法達(dá)到預(yù)期目標(biāo)的擴(kuò)增。那么，如果可以的話，盡量選擇其它不含這段基序的區(qū)域作為目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域。

7.     引物噪音

       通常除了特異性擴(kuò)增發(fā)生之外，RPA反應(yīng)體系也容易引起引物之間非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。這種非特異性擴(kuò)增可以是由分子內(nèi)的(發(fā)夾結(jié)構(gòu))序列引起，也可以是由相同或不同引物之間的序列所引起。這種非特異性擴(kuò)增可以產(chǎn)生可檢測水平的信號(hào)，即引物的噪音。噪音反應(yīng)與特異性擴(kuò)增過程競爭(對于引物、核苷酸、聚合酶結(jié)合和能量),并將最終抑制后者。產(chǎn)生噪音的傾向會(huì)影響特定引物對的靈敏度。由于這個(gè)原因，引物的選擇尤為重要。

8.     簡并引物和錯(cuò)配

RPA通常對錯(cuò)配是耐受的。有研究表明，當(dāng)引物和探針攜帶5-9個(gè)堿基對錯(cuò)配時(shí)，RPA的擴(kuò)增性能可能不受影響。因此，可以盡量減少在RPA反應(yīng)中使用簡并堿基。

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