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MIRA結(jié)合CRISPR雙靶標(biāo)基因檢測

文章信息
期刊名稱:《Journal of Advanced Research》
文章標(biāo)題:《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》
影響因子:11.4
研究團(tuán)隊(duì):浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院汪小福
原文鏈接:http://www.amp-future.com/vip_doc/28586987.html

轉(zhuǎn)基因作物已在世界各地廣泛種植,許多國家逐步完善轉(zhuǎn)基因監(jiān)管措施以確保轉(zhuǎn)基因作物的安全。開發(fā)快速和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場檢測方法對(duì)農(nóng)業(yè)和生物安全非常重要,可以減輕公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的擔(dān)心。

在本研究中,課題組開發(fā)了一種新的一鍋法反應(yīng)——雙重MIRA檢測結(jié)合雙重CRISPR(MR-DCA方法),用于同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點(diǎn),為轉(zhuǎn)基因作物的檢測提供了一種簡單高效的方法。

Part 01實(shí)驗(yàn)方法

 

將雙重MIRA產(chǎn)物用雙Cas13a、Cas12a系統(tǒng)進(jìn)行分析,產(chǎn)生兩個(gè)互不干擾的獨(dú)立信號(hào),再通過照明儀器讀取熒光顏色,或通過帶有兩條T線的試紙條,以實(shí)現(xiàn)雙通道讀出。整個(gè)過程在不到35min的時(shí)間內(nèi)完成,檢測限低至20個(gè)拷貝。

                                                                    (MR-DCA檢測CaMV35S和NOS的原理)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)步驟:MIRA擴(kuò)增、CRISPR反應(yīng)、2種方式的結(jié)果判讀。

CaMV35S基因作為Cas13a的靶標(biāo),NOS基因作為Cas12a的靶標(biāo),分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)MIRA引物。Cas13a系統(tǒng)只識(shí)別RNA,因此設(shè)計(jì)了正向引物區(qū)域,包含一個(gè)T7啟動(dòng)子,用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄,激活Cas13a。為NOS基因增加一個(gè)PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結(jié)合,且兩個(gè)系統(tǒng)之間不存在干擾或交叉反應(yīng)。

Part 02實(shí)驗(yàn)情況

靈敏度和特異性

將樣本梯度稀釋來測試MIRA反應(yīng)的熒光強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)樣本濃度在20μL時(shí)仍能檢測到熒光強(qiáng)度,最終實(shí)驗(yàn)選定20μL的濃度。

 

                                                                            (不同樣本濃度和熒光強(qiáng)度測試)

 

                                                          (不同樣本濃度和試紙條顯色測試并用強(qiáng)度量化計(jì)算)

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)MR-DCA的特異性,課題組對(duì)非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物混合樣品和非轉(zhuǎn)基因植物混合樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉(zhuǎn)基因樣品具有較高的熒光信號(hào),而其他樣品的熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點(diǎn)核酸檢測平臺(tái)。

MR-DCA對(duì)24個(gè)作物樣品進(jìn)行了測試。其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉(zhuǎn)基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子轉(zhuǎn)基因大豆。

 

                                                                                 (24個(gè)樣本的檢測結(jié)果)

 

反應(yīng)快速

反應(yīng)時(shí)間是現(xiàn)場檢測的一個(gè)重要因素,課題組觀察到在反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí),就已經(jīng)能用熒光儀檢測到FAM和HEX的熒光信號(hào)。MIRA結(jié)合CRISPR反應(yīng),也在15min后觀察到黃色熒光。

 

                                                                            (不同MIRA反應(yīng)時(shí)間下的熒光信號(hào))

 

                                               (MIRA反應(yīng)不同時(shí)間下的試紙條顯色并用強(qiáng)度量化計(jì)算)


實(shí)驗(yàn)結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該雙重MIRA具有良好的特異性,并能準(zhǔn)確地獲得CaMV35S和NOS的擴(kuò)增產(chǎn)物,Cas13a和Cas12a系統(tǒng)獨(dú)立反應(yīng),互不干擾。MR-DCA檢測能在35min的低溫下準(zhǔn)確檢測到20個(gè)拷貝,具有在田間檢測轉(zhuǎn)基因作物的巨大價(jià)值。

相關(guān)產(chǎn)品:

MIRA試劑盒及試紙條系列:

貨號(hào)

產(chǎn)品

規(guī)格

JY0209

雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0201

單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0307

Tiosbio? CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條(變色龍)

50T

WLB8201KIT

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLE8202KIT

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(熒光型)

48T

WLN8203KIT

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLRB8204KIT

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型)

48T

WLRE8205KIT

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(熒光型)

48T

WLRN8206KIT

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLB5001

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLN5002

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLR5003

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體熒光型)

100T

WLRB5001

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體基礎(chǔ)型)

100T

WLRN5002

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLRE5003

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體熒光型)

100T

 

Cas酶系列

貨號(hào)

包裝規(guī)格

中文名稱

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32101-01

100 pmoL

SpCas9

32101-03

1,000 pmoL

SpCas9

32102-01

100 pmoL

Sp-dCas9

32102-03

1,000 pmoL

Sp-dCas9

32120-01

100 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

32120-03

1,000 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

 

 

 

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