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常見(jiàn)問(wèn)題 (Frequently asked questions) :
一、產(chǎn)品如何保存?
答復(fù):本品以凍干粉形式提供，收到產(chǎn)品需2-8°C干燥保存。本品置于30°C，3個(gè)月酶活力損失約70%。本品溶于緩沖液配制成儲(chǔ)存液后，短期置于2-8°C保存，約2周穩(wěn)定。長(zhǎng)期請(qǐng)置于-20°C保存，約數(shù)月穩(wěn)定。
二、凍干粉如何溶解?
答復(fù): 本品易溶于水。建議用1/15M phosphate buffer (pH 7.5) 溶解，或用自己實(shí)驗(yàn)體系相關(guān)緩沖液來(lái)解。儲(chǔ)存液的制備方法比較多，主要根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)體系，或參考文獻(xiàn)來(lái)操作。短期置于2-8°C保存，約2周穩(wěn)定。長(zhǎng)期請(qǐng)置于-20°C保存，約數(shù)月穩(wěn)定
三、 如何制備無(wú)菌酶溶液?
答復(fù): 若需要制備無(wú)菌酶溶液，請(qǐng)用除硝酸纖維素膜之外的0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌。
四、 酶的比活力是多少?
答復(fù): Zymolyase-20T指的是酶的比活力約20，000 units/g (20 Ku/mg)，具體批次酶的比活力是有變化的，詳細(xì)請(qǐng)見(jiàn)產(chǎn)品標(biāo)簽或質(zhì)檢報(bào)告。
五、 Zymolyase適用于哪些菌株類型?
答復(fù): 該酶的裂解譜(lytic spectrum) 包含以下菌屬: Ashbya (阿舒囊霉屬)，Candida (假絲酵母屬),Debaryomyces (德巴利 (氏) 酵母屬),Eremothecium(假囊酵母屬),Endomyces(內(nèi)抱霉),Hansenula(漢遜氏酵母),Hanseniaspora(泡漢遜酵母屬),Kloeckera(克勒克酵母屬),kuyveromyces (克維酵母屬),Lipomyces(油脂酵母屬),Metschnikowia(梅奇酵母屬),Pichia(畢赤酵母屬),Pullularia(芽霉菌屬),Torulopsis(球擬酵母菌),Saccharomyces(酵母屬),Saccharomycopsis(復(fù)膜酵母菌屬),Saccharomycodes(類酵母屬),Schwanniomyces(許旺酵母菌屬)，等等。其他未羅列在內(nèi)的菌屬請(qǐng)查閱文獻(xiàn)或和我司聯(lián)系是否有相關(guān)應(yīng)用數(shù)據(jù)
六、 Zymolyase適用于絲狀真菌嗎?
答復(fù): 該酶主要用于酵母細(xì)胞壁的裂解，對(duì)于絲狀真菌，雖然與酵母細(xì)胞壁在結(jié)構(gòu)上有很多相似，但裂解效果因菌株類型有差異。建議用復(fù)合酶的形式來(lái)特異裂解絲狀真菌，或選用我司提供的真菌溶壁酶。
七、酶的工作濃度一般是多少?
答復(fù)：不同的酵母菌株對(duì)酶的敏感性會(huì)有差異，請(qǐng)參閱文獻(xiàn)或根據(jù)實(shí)際的裂解經(jīng)驗(yàn)來(lái)設(shè)定合適的工作濃度。操作方法可參考下方流程。
操作步驟(僅作參考，實(shí)際應(yīng)用可做適當(dāng)調(diào)整)
一、Zymolyase-20T儲(chǔ)存液制備
此配制方法針對(duì)以下步驟來(lái)設(shè)置，也可以適用其他適當(dāng)?shù)娜軇┤?/span>1/15M phosphate buffer(pH 7.5)、10mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 等。
將低溫保存的凍干粉從冰箱取出，回置室溫，低速離心后，稱取適量粉未溶于無(wú)菌S緩沖液(1.0 M Sorbitol,10 mM PIPES,pH 6.5) 配制成10mg/ml (200U/ml) 儲(chǔ)存液，置于4能穩(wěn)定保存2周(無(wú)菌條件下)。
二、制備原生質(zhì)球 (Spheroplasting protocol)
2.1 室溫條件，5000rpm (3000 xg) ，5min離心酵母培養(yǎng)物;
2.2 吸掉上清，收集離心沉淀(酵母細(xì)胞) ，記錄濕重;
2.3 用TE緩沖液 (100 mM Tris，pH 8.0，100 mM EDTA) 重懸酵母細(xì)胞，按照1.4m/g濕重細(xì)胞加量。并用去離子水定容到終體積 3.5ml/g濕重細(xì)胞。
2.4 按照17.5 μl/g濕重細(xì)胞加入β -疏基醇，目的是為了除去細(xì)胞外層甘需聚糖層;
2.5 30°C孵育并保持低速搖晃，處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的酵母孵育15min，處于穩(wěn)定期生長(zhǎng)的酵母孵45min
2.6 室溫條件，5000rpm離心5min:
2.7 用S緩沖液 (1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES,pH 6.5) 重懸細(xì)胞，加4.0ml S緩沖液/g濕重細(xì)胞
2.8 室溫條件，5000rpm離心5min;
2.9 再次用S緩沖液(4.0ml/g濕重細(xì)胞) 重懸細(xì)胞，另加入Zymolyases (50U/g濕重細(xì)胞，對(duì)200U/ml儲(chǔ)存液，則加入250ul);初始用此酶，最好根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行用量的優(yōu)化。
2.10 30°C輕搖溫育混合液30min，根據(jù)以下方式監(jiān)測(cè)原生質(zhì)球形成程度:
a)加1ul樣品到20ul S緩沖液內(nèi)，原生質(zhì)球應(yīng)該保持完整:
b) 加1ul樣品到20ul去離子水中，原生質(zhì)球應(yīng)該破裂:顯微鏡下觀察比較兩個(gè)樣品。
2.11 一般情況下反應(yīng)45-60min，原生質(zhì)球的形成量>90%，此時(shí)4℃下離心收集細(xì)胞，5000rpm，5min:
2.12 再次用S緩沖液(2 ml/g濕重細(xì)胞) 重懸原生質(zhì)球，5000rpm離心5min; 重復(fù)此步驟2次
2.13 原生質(zhì)球沉淀可置于-70℃凍存。
三、酵母基因組DNA的制備 (Preparation of yeast genomic DNA)
以下操作步驟簡(jiǎn)單快速，適合于少量酵母培養(yǎng)物內(nèi)基因組DNA的制備.
3.1 將過(guò)夜培養(yǎng)的10ml酵母菌培養(yǎng)物離心收集沉淀，加入280ul TE Buffer,30 ul去離子水和3 ul β-疏基乙醇;
3.3 30℃溫育45min;
3.3 以臺(tái)式離心機(jī)的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀用500ul S緩沖液重懸，再次離心棄上清:
3.4 用500ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T的S緩沖液重懸沉淀(或者使用自行優(yōu)化后的最佳酶濃度)
3.5 30℃溫育1h;
3.6 重復(fù)步驟3.3
3.7 用200ul含有0.1%SDS和2ug蛋白酶K的TE buffer重懸沉淀
3.8 37℃溫育3小時(shí)，中間時(shí)不時(shí)的混勻下溶液
3.9 轉(zhuǎn)到65℃溫育20min; 從水浴鍋內(nèi)取出并冷卻至室溫
3.10 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，游渦混勻并離心: 從離心機(jī)內(nèi)取出并保留上清液
3.11 用200ul氯仿基取上清液，之后重復(fù)旋渦混勻及離心:
3.12 加入500ul 95%乙醇到上清液內(nèi)，20℃沉淀10min:
3.13 4℃下，15000 xg離心20 min;
3.14 自然風(fēng)干或者于真空離心基發(fā)濃縮器內(nèi)晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液(合有150 mMNaCI和1 ug RNase A) 溶解DNA;
3.15 37℃溫育1小時(shí):
3.16 重復(fù)步聚3.10和3.11:
3.17 加入2.5倍體積的95%乙醇，20℃沉淀10min;
3.18 30ul去離子水重懸DNA。對(duì)1:500的DNA稀釋液測(cè)量A260，根據(jù)消光系數(shù)計(jì)算DNA產(chǎn)量;產(chǎn)量大約為40-50ug。