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卡那霉素（Kan）是一種含有順二醇的氨基糖苷類抗生素，通常用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)預(yù)防細(xì)菌感染?？敲顾卮蠖嘤蓜?dòng)物的腎臟代謝為糖苷并通過尿液排出，但Kan的濫用導(dǎo)致動(dòng)物源性食品和水樣中存在抗生素殘留，最終可能在人體內(nèi)產(chǎn)生累積，可能會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重的副作用（如腎毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性和過敏反應(yīng)），甚至產(chǎn)生抗生素耐藥性。近年來，各種分析技術(shù)已被應(yīng)用于抗生素殘留的靈敏檢測，包括電泳、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光法和高效液相色譜法，但是大多數(shù)技術(shù)仍存在操作繁瑣、成本高、操作時(shí)間長等局限性。因此，需要一種簡單、快速、超靈敏的抗生素檢測策略。今年3月，廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所陳俊華等研究人員開發(fā)了一種基于血糖儀和CRISPR-Cas12a的卡那霉素（Kan）檢測方案，該方案具有操作簡單、成本低、便于大眾使用等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，堅(jiān)固耐用，可以在資源有限的環(huán)境下實(shí)現(xiàn)抗生素殘留的現(xiàn)場檢測。其線性范圍為1 pM ~ 100 nM，檢出限為1 pM。

01檢測原理

本研究的基本思路如下：適配體與Kan相互作用釋放觸發(fā)C鏈，啟動(dòng)發(fā)夾組裝產(chǎn)生許多雙鏈DNA。這些雙鏈DNA作為CRISPR-Cas12a的識(shí)別底物，導(dǎo)致Cas12a反式剪切活性被激發(fā)，切割磁珠和轉(zhuǎn)化酶修飾的單鏈DNA。磁分離后，轉(zhuǎn)化酶可以將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖可以通過血糖儀進(jìn)行定量（圖1）。

                                                     圖1.基于CRISPR/Cas12a和血糖儀檢測Kan的原理

02.Kan便攜式檢測的可行性驗(yàn)證

作者在不同的條件下，研究了該方案的可行性。如圖2A所示，沒有目標(biāo)Kan，C鏈在DNA1-DNA2雙鏈中被阻斷，H1和H2的組裝無法發(fā)生（直方圖a）。如果傳感系統(tǒng)中不存在H1（直方圖b），與直方圖a相比，血糖讀數(shù)沒有明顯變化。在缺少Cas12a的情況下（直方圖c）， Cas12a介導(dǎo)的裂解功能無法發(fā)揮作用，血糖儀信號(hào)可以忽略不計(jì)。正如預(yù)期的那樣，只有當(dāng)檢測系統(tǒng)中所有組分都完整時(shí)，才能產(chǎn)生血糖儀讀數(shù)（直方圖d）。

圖2B記錄了血糖儀試紙圓形對(duì)照窗口中相應(yīng)的顏色變化。在所有傳感元件和Kan存在的情況下，蔗糖可以通過釋放的轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而產(chǎn)生綠色變化，其他三個(gè)對(duì)照條件試紙的顏色保持黃色。此外，還利用PAGE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了傳感器的可行性。如圖2C所示，上述結(jié)果表明，該傳感原理對(duì)Kan檢測是可行的。

圖2. 基于CRISPR/Cas12a和血糖儀檢測Kan的可行性分析

03.Kan便攜式檢測體系優(yōu)化
為了獲得更好的用于Kan檢測的血糖儀傳感器的分析結(jié)果，對(duì)C鏈的支點(diǎn)（結(jié)構(gòu)域1）長度、體系的反應(yīng)溫度、與Cas12a的反應(yīng)時(shí)間以及蔗糖濃度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化（圖3）。首先對(duì)C鏈的支點(diǎn)長度進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳長度8 nt，過短的話會(huì)影響鏈置換?？紤]到最佳的信噪比（S/N），選擇25℃作為最佳反應(yīng)溫度。90 min內(nèi)血糖儀信號(hào)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，90 min后響應(yīng)信號(hào)停止增加，因此，Cas12a的最佳反應(yīng)時(shí)間為90 min。進(jìn)一步優(yōu)化了蔗糖濃度，0.2-0.5 M信號(hào)值增加，0.5 M以后基本達(dá)到平臺(tái)期，因此最佳濃度為0.5 M (圖3)。

圖3. 檢測體系優(yōu)化

04.Kan便攜式檢測體系靈敏度與特異性評(píng)估

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，研究了Kan濃度與血糖儀讀數(shù)的關(guān)系。如圖4A所示，隨著Kan濃度的增加，血糖儀讀數(shù)逐漸增加。同時(shí)記錄血糖儀試紙條圓形控制窗口的顏色變化情況，隨著Kan濃度的增加，條帶的顏色逐漸由黃色變?yōu)榫G色（圖4B）。與空白樣品相比，1 pM Kan可以產(chǎn)生明顯的顏色變化，這可以定義為傳感系統(tǒng)的檢測限。如此高的靈敏度可歸因于發(fā)夾DNA的循環(huán)組裝過程，Cas12a的切割能力以及轉(zhuǎn)化酶的多重轉(zhuǎn)化效率。

圖4. Kan檢測靈敏度分析

以QUI、ENR、CHL、TET、EPI、LIN、STR、VIB等非靶標(biāo)抗生素作為干擾分子，檢測血糖傳感器的特異性。Kan濃度為1 nM，對(duì)照抗生素濃度為100 nM。如圖5所示，在Kan存在下，試紙條顏色為綠色，血糖儀信號(hào)高。在干擾抗生素存在的情況下，試紙的顏色仍為黃色，與空白樣品幾乎相同。這些結(jié)果表明，對(duì)照分子不干擾生物傳感器的分析性能。該傳感系統(tǒng)優(yōu)異的特異性可歸因于適配體對(duì)Kan的特異性識(shí)別。

圖5. Kan檢測特異性分析

05.實(shí)際樣本的檢測

為了證明基于CRISPR/Cas12a和血糖儀的Kan檢測生物傳感器的實(shí)用性，研究者檢測了實(shí)際水和牛奶樣品中的Kan。使用開發(fā)的生物傳感器和商用ELISA試劑盒對(duì)Kan濃度分別為1、5、20、50、100 nM的水和牛奶樣品進(jìn)行檢測。如表1所示，水樣的回收率為89 ~107.2%，牛奶樣品的回收率為86 ~ 106.5%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%。同時(shí)，用商用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒對(duì)樣品中Kan的濃度進(jìn)行驗(yàn)證。血糖儀檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果吻合較好。相對(duì)誤差（Re）在- 4.3% ~5.5%之間。這些結(jié)果表明，血糖傳感器具有很強(qiáng)的實(shí)用性，可以在復(fù)雜的樣品中工作，具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

表1. 使用傳感器和ELISA試劑盒檢測水樣和牛奶中的Kan

總結(jié)

本文報(bào)道了一種簡單、靈敏的現(xiàn)場檢測Kan的方法，使用血糖儀作為檢測器。該方案結(jié)合了CRISPR/Cas12a系統(tǒng)和血糖檢測儀系統(tǒng)的優(yōu)勢，具有成本低、操作簡單、靈敏度和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)復(fù)雜樣品中的Kan進(jìn)行現(xiàn)場檢測。可以設(shè)想，結(jié)合CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的血糖儀生物傳感器可以通過簡單地替換抗生素適配體，為其它抗生素的檢測提供一個(gè)通用的傳感平臺(tái)，但不能用于多種抗生素的同時(shí)測定。ToloBio可提供Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14（Cas12f）、Cas9等多種CRISPR核心蛋白酶。

參考文獻(xiàn)：

[1].Chen J, Shi G, Yan C. Portable biosensor for on-site detection of kanamycin in water samples based on CRISPR-Cas12a and an off-the-shelf glucometer. Sci Total Environ. 2023 May 10;872:162279. doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162279. Epub 2023 Feb 16. PMID: 36801336.

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