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猴痘病毒是一種包膜雙鏈DNA病毒，主要通過(guò)呼吸道飛沫、體液、分泌物、傷口或病毒污染物進(jìn)行傳播。人感染猴痘會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、咳嗽、淋巴腫大等癥狀，還可能并發(fā)細(xì)菌感染、敗血癥、肺部感染、呼吸窘迫綜合癥等。阻斷猴痘病毒的傳播主要以預(yù)防為主，同時(shí)對(duì)病原檢測(cè)及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒阻斷病毒的傳播顯得十分重要。一般來(lái)說(shuō)，qPCR是猴痘病毒首選的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案，但從對(duì)抗新冠疫情中得到的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)表明，預(yù)防突發(fā)大流行的源頭是向個(gè)人提供快速可靠的即時(shí)診斷工具，抗原檢測(cè)在新冠病毒檢測(cè)中扮演了這一角色，但也暴露出抗原檢測(cè)的準(zhǔn)確度仍亟待提升的問(wèn)題。對(duì)于猴痘病毒，其抗原的低特異性使其更容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，因此猴痘病毒的即時(shí)診斷難以通過(guò)抗原檢測(cè)的方式實(shí)現(xiàn)。

近日，一項(xiàng)發(fā)表于《Sensors and Actuators B: Chemical》的研究介紹了一款特殊的猴痘病毒檢測(cè)裝置，該裝置包含了以RPA和CRISPR-Cas12a技術(shù)作為原理的凍干型檢測(cè)試劑，可在35分鐘內(nèi)完成對(duì)猴痘病毒的快速自測(cè)。

01RPA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)猴痘的策略

該檢測(cè)的原理首先利用了RPA法對(duì)猴痘病毒核酸指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的能力，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)先設(shè)計(jì)好的gRNA和Cas12a酶組成的RNP復(fù)合物結(jié)合，RNP復(fù)合物與猴痘病毒特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的相互作用激活了Cas12a酶的反式切割活性，導(dǎo)致ssDNA報(bào)告探針被切割而產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光。另外，RPA和CRISPR/Cas12a的反應(yīng)體系具有很好的兼容性，這種集成的RPA-CRISPR/Cas12a反應(yīng)可以在單一的溫度和單個(gè)試管中進(jìn)行，避免了氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性（圖1）。

圖1.CRPA-CRISPR檢測(cè)猴痘病毒的基本原理

02CRISPR 解決恒溫?cái)U(kuò)增非特異的困局

研究人員選取了猴痘病毒的B6R和F3L基因作為檢測(cè)的靶標(biāo)，并針對(duì)這兩個(gè)基因篩選了多對(duì)RPA引物。盡管如此，在對(duì)模擬樣本進(jìn)行獨(dú)立RPA擴(kuò)增測(cè)試的過(guò)程中仍出現(xiàn)了較多的非特異性擴(kuò)增，這與RPA方法的擴(kuò)增原理相關(guān)。為了解決檢測(cè)過(guò)程中非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題，研究人員嘗試將CRISPR-Cas12a核酸檢測(cè)技術(shù)與RPA方法相結(jié)合，并分析相同的樣品。結(jié)果證明該方法使檢測(cè)的特異性得到了明顯的提升，CRISPR-Cas12a識(shí)別了RPA擴(kuò)增子的特定序列，并將其與非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖2）。

圖2. RPA與CRISPR技術(shù)相結(jié)合的必要性

03基于CRISPR的猴痘病毒POCT檢測(cè)裝置

在成功開(kāi)發(fā)了RPA-CRISPR / Cas12a檢測(cè)方法后，研究人員將所有試劑進(jìn)行凍干并集成到一個(gè)便攜式的MASTR袋中以檢測(cè)猴痘病毒。MASTR 袋中的主要組件包括迷你移液器、即用型管、采樣管、迷你移動(dòng)電源、自動(dòng)讀出裝置和迷你恒溫加熱塊，通過(guò)檢測(cè)在RPA-CRISPR/Cas12a部分的同一批次樣品來(lái)驗(yàn)證MASTR袋的可行性，用于檢測(cè)質(zhì)粒和病毒。測(cè)試結(jié)果表明，陽(yáng)性結(jié)果發(fā)出明亮的熒光，陰性結(jié)果僅存在較低的背景信號(hào)；證明 MASTR 袋具有便攜和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，且沒(méi)有假陽(yáng)性的結(jié)果（圖3）。

圖3. 基于RPA-CRISPR凍干試劑的即時(shí)診斷裝置

研究人員還使用MASTR袋測(cè)試了各種類型的模擬臨床標(biāo)本，結(jié)果表明MASTR袋擁有與qPCR實(shí)驗(yàn)室測(cè)試相當(dāng)?shù)奶禺愋耘c靈敏度，證明了MASTR袋檢測(cè)猴痘病毒的準(zhǔn)確性（圖4）。

圖4. MASTR袋的性能驗(yàn)證 

盡管如此，該研究在也存在一定的局限性，主要體現(xiàn)在未能獲得并檢測(cè)真實(shí)的猴痘臨床標(biāo)本，但這與當(dāng)前猴痘患者的總體數(shù)量稀少相關(guān)。不可否認(rèn)的是，這款RPA-CRISPR凍干型裝置在猴痘病毒的即時(shí)檢測(cè)方面具有較大的潛力，有望通過(guò)早期疾病的檢測(cè)來(lái)幫助防控猴痘疫情。 

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