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解決免疫共沉淀(Co-IP)中的抗體輕重鏈污染問題

解決免疫共沉淀(Co-IP)中的抗體輕重鏈污染問題

1.    免疫共沉淀-互作研究經(jīng)典方法

免疫共沉淀(Co-ImmunoprecipitationCoIP)是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法,常用于發(fā)現(xiàn)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)、鑒定兩蛋白的互作關(guān)系。

CoIP的設(shè)計原理是,假設(shè)一種已知蛋白是某個大的蛋白復(fù)合物的組成成員,那么利用這種蛋白的特異性抗體,就可以將整個蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來(常說的“pull-down”),進(jìn)而可以用于鑒定這個蛋白復(fù)合物中的其他未知成員。

CoIP的特點可以概括為兩點,第一是天然狀態(tài)蛋白,第二是蛋白復(fù)合物。

大致流程如下圖所示:


2.哪有那么簡單

上面講了原理和流程,看起來很好理解。但研究中往往不像理論那么順利。

在做CoIP實驗過程中往往會遇到目的蛋白與抗體輕鏈(25kDa左右)或者抗體重鏈(55kDa左右)的分子量接近的情況,導(dǎo)致IP-WB檢測時無法判斷目的蛋白條帶(如上圖)。

如何解決這種問題,困擾了非常多的小伙伴。

3. 問題的根源

其實產(chǎn)生抗體輕、重鏈條帶污染的主要原因是,我們上二抗的時候,PVDF膜上有兩種一抗:

1)用于CoIP的一抗脫落后跑電泳并轉(zhuǎn)印到膜上(上圖紅圈所示)

2)IP-WB時加入的一抗(上圖紅色箭頭對應(yīng)的一抗)。

二抗同時識別上面兩種一抗,導(dǎo)致除了目標(biāo)條帶(紅色箭頭)外,還產(chǎn)生抗體的輕鏈和重鏈條帶(黑色箭頭)。

4. 解法

要解決該問題主要就是處理掉圖中的輕、重鏈條帶。

那我們知道做WB要有條帶需要2個要素:目標(biāo)蛋白、抗體及發(fā)光基團。

解法就是分別解決這3個要素,任意一個要素解決了問題就解決了。

1)  Co-IP抗體共價偶聯(lián)到磁珠或者Agarose——這樣在洗脫的時候,抗體就不會被洗到CoIP產(chǎn)物中去。

(產(chǎn)品推薦:A10003 NHS-Activated Magarose Beads,或者M2001X系列Tag-Agarose beads產(chǎn)品);


 2)  IP-WB檢測一抗直接標(biāo)記HRP,WB實驗過程中不使用二抗——這樣就不會發(fā)生二抗識別CoIP產(chǎn)物中一抗抗體。

(產(chǎn)品推薦:M200系列HRP標(biāo)記標(biāo)簽抗體);

 3)  使用一款只識別天然構(gòu)象抗體的二抗——由于WB過程中,CoIP產(chǎn)物中一抗抗體變性,該二抗不會識別產(chǎn)生條帶。

(產(chǎn)品推薦:AbSmart系列二抗);

上述3種方法中:購買共價偶聯(lián)好的Tag-Agarose beads或者HRP標(biāo)記的標(biāo)簽抗體,使用起來很方便,作為實驗首選。

但是絕大多數(shù)一抗是沒有HRP標(biāo)記的或者共價偶聯(lián)beads的,所以很多實驗室在做內(nèi)源性蛋白Co-IP實驗時就會很煩惱,這時候使用避免抗體輕重鏈的AbSmart系列二抗,就可以有效地解決這類問題,作為內(nèi)源性蛋白的Co-IP實驗的首選。

另外如果Co-IP之后,需要質(zhì)譜鑒定互作蛋白或修飾時,為了排除質(zhì)譜檢測時抗體的干擾,可以選擇使用NHS- Activated Magarose Beads來共價偶聯(lián)一抗,然后做CoIP實驗將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測,這樣可以大大提高質(zhì)譜檢出蛋白的數(shù)量和修飾位點的靈敏度。

下面給大家分享一個實驗結(jié)果案例:


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1.Tag-Agarose beads產(chǎn)品

M20012:Anti-Myc-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20013:Anti-HA-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20014:Anti-GFP-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20018:Anti-DYKDDDDK-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

2.HRP標(biāo)記的tag產(chǎn)品

M20019: Anti-Myc-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20020: Anti-His-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20021: Anti-Ha-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20022: Anti-GFP-Tag Antibody(HRP Conjugated) 

M20025: Anti-GST-Tag Antibody(HRPConjugated) 

M20026: Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody(HRPConjugated) 

3.避免抗體輕重鏈二抗產(chǎn)品

AbSmart-M21004:Goat Anti-Mouse IgG HRP(避免重鏈)

AbSmart-M21005: GoatAnti-Mouse IgG HRP(避免輕鏈)

AbSmart-M21006: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免重鏈)

AbSmart-M21007: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免輕鏈)

4.共價偶聯(lián)Agarose產(chǎn)品

A10003: NHS- ActivatedMagarose Beads

注意:

有同學(xué)反饋說使用共價偶聯(lián)好的Tag-Agarose beads產(chǎn)品,在做CoIP-WB檢測的時候,也會出現(xiàn)抗體輕重鏈。

詳細(xì)了解實驗流程后,發(fā)現(xiàn)是由于CoIP實驗的最后一步(互作蛋白洗脫步驟)操作錯誤導(dǎo)致。

即很多同學(xué)在3PBST洗滌之后,直接就加入WB Loading buffer進(jìn)行煮樣,然后就進(jìn)行SDS-PAGE上樣了。這樣操作會導(dǎo)致共價偶聯(lián)的抗體被分離下來,在WB中出現(xiàn)抗體輕重鏈的條帶。

正確的操作應(yīng)該是:1. 3次PBST洗滌之后,加入50-100ulPH2.5-3.0的甘氨酸溶液(加入體積根據(jù)實驗需求自行調(diào)整);2. 震蕩混勻,靜置30-60s,離心取上清(磁珠用磁力架);3. 上清中按照體積比1:10(中和液/甘氨酸)加入中和液(中和液為PH9.0Tris溶液);4. 后續(xù)在上清液中正常加入WB Loading buffer操作即可。

為了方便大家實驗操作,Abmart為大家提供了配置好的洗脫液和中和液產(chǎn)品(貨號T10007),該產(chǎn)品也可以作為ProA/G產(chǎn)品的洗脫液和中和液。如果是使用Flag抗體進(jìn)行CoIP實驗,可以使用3*DDDDK多肽(貨號T10004)進(jìn)行洗脫,該產(chǎn)品針對非共價偶聯(lián)的Flag抗體進(jìn)行的CoIP實驗,一樣可以起到避免抗體輕重鏈污染的問題。




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