細(xì)胞DNA常用標(biāo)記染料
細(xì)胞DNA常用標(biāo)記染料
細(xì)胞的DNA可以被多種染料標(biāo)記
例如：碘化丙啶（PI）（貨號：P9206）
溴化乙錠
Hoechst 染料，主要是 Hoechst 33342（貨號：S6223） 和 Hoechst 33258（貨號：S6201）
Mithramycin A (Plicamycin) 光輝霉素A（貨號：CB798）
DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）（貨號：P4210）
7-氨基放線菌素D（7-AAD）（貨號：S8221）
TO-PRO-3染色劑
色霉素（Chromomycin）（貨號 ：S8225）
最常用的 DNA 染料是碘化丙啶 (PI)，可嵌入 DNA 雙螺旋中并發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（最大發(fā)射波長 637nm）。它的優(yōu)點(diǎn)是可被 488nm 光激發(fā)，可用于最常見的臺式流式細(xì)胞儀。然而，PI染色需要固定或透化細(xì)胞，因此細(xì)胞無法存活。PI 也會和雙鏈 RNA 結(jié)合，所以染色時(shí)需用RNA酶去除。
如果需要保證細(xì)胞是活的，或者需要同時(shí)做表面標(biāo)記或胞內(nèi)標(biāo)記（雖然PI也能用多聚甲醛固定和皂素破膜做，但難度較高），可選擇 Hoechst 33342，它與 DNA 中富含 AT 的區(qū)域結(jié)合，無需固定即可進(jìn)入活細(xì)胞，因此細(xì)胞可以在染色之后繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行后續(xù)操作。這種方法的缺點(diǎn)是 Hoechst 33342 通過紫外光激發(fā)，因此不能用于大多數(shù)臺式流式細(xì)胞儀。
PI染色檢測細(xì)胞周期的染色步驟
I.材料
1、70% 乙醇，保存在– 20度
2、DNA 染色液（10ml，新鮮配制）的組成:
①Triton–X 100 10uL
②1mg/ml碘化丙碇 200uL
③DNase-free RNase 2mg
④PBS 9.79ml
注：1mg/ml的PI儲存液是由1 mg PI溶于1 ml蒸餾水中配制而成，可在0℃到4℃保存數(shù)月。
如果RNase不是DNase-free，可將2 mg RNase A在1 ml蒸餾水中煮沸5分鐘。
II.步驟
取1x106 細(xì)胞/管，PBS洗滌兩次，每次250g離心5分鐘。
盡可能完全去除上清，加入1ml于－20℃ 預(yù)冷的70%乙醇，注意，要邊振蕩邊加。
標(biāo)本保存于-20℃，直至要進(jìn)行DNA染色（可保存數(shù)周至數(shù)月）
染色當(dāng)天取出標(biāo)本，于250 x g 離心5分鐘，盡可能完全去除上清，然后再用PBS洗滌1－2次，離心速度250g×5分鐘。
加入1 ml DNA染色液，充分振蕩，染色15分鐘即可上機(jī)檢測。
以上是比較快速的步驟您也可以先用RNAse作用30分鐘（常溫或37度均可，但需注意有些細(xì)胞可能不適合，需對比測試），然后再用染色液孵育15分鐘。
這幾種作用方式結(jié)果無差別：
Hoechst 33342檢測細(xì)胞周期的染色步驟
在 37°C 下用 Hoechst 33342孵育細(xì)胞 10-60 分鐘。使用的 Hoechst 濃度必須預(yù)先優(yōu)化，因?yàn)椴煌?xì)胞的最佳濃度會有所不同，一般在 5-20μg/ml 的范圍內(nèi)。
孵育完畢，以 1000 轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘。在 PBS 中洗滌2次。必要時(shí)，可加入低濃度的PI孵育1分鐘排除死細(xì)胞。
上機(jī)，收集 390nm 和 480nm 波長之間的 Hoechst 熒光。
分析
無論是PI染色還是Hoechst 33342染色，均需事先進(jìn)行粘連體排除，詳見：
PI檢測細(xì)胞周期時(shí)如何排除粘連體
參考資料：http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto3/8/data/icrf/cycle.htm