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產(chǎn)品簡(jiǎn)介

DAF-FM DA即4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate，也稱DAF-FM Diacetate，是最新一代用于一氧化氮（nitric oxide, NO）定量檢測(cè)的探針，其檢測(cè)原理為：DAF-FM DA可以穿過(guò)活細(xì)胞膜（cell-permeable），進(jìn)入細(xì)胞后可以被胞漿內(nèi)的酯酶催化形成不能穿過(guò)細(xì)胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身僅有很弱的熒光，光量子約0.005，但在與NO反應(yīng)后生成熒光素-苯駢三氮唑（benzotriazole），發(fā)強(qiáng)烈綠色熒光，光量子約0.81。Ex~495 nm，Em~515 nm。任何可以檢測(cè)熒光素（fluorescein）的儀器，包括熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀都可以用于該熒光探針的檢測(cè)。

DAF-FM DA是最新一代NO檢測(cè)探針，與以往最成功且應(yīng)用最廣泛的一氧化氮熒光檢測(cè)探針DAF-2 Diacetate相比較，具有多方面的改進(jìn)：1）DAF-FM DA和NO加合反應(yīng)形成的熒光產(chǎn)物在pH5.5以上不受pH影響；2）DAF-FM DA和NO加合反應(yīng)形成的產(chǎn)物熒光更加穩(wěn)定，不容易淬滅，這樣更加便于檢測(cè)；3）DAF-FM DA對(duì)一氧化氮的檢測(cè)靈敏度更高，其最低檢測(cè)濃度可達(dá)到3 nM，而DAF-2 Diacetate的最低檢測(cè)濃度約為5 nM。

本品適用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮水平，推薦工作濃度為1-10 µM。如果收集細(xì)胞后再裝載探針，通常至少可以檢測(cè)100個(gè)樣品。

產(chǎn)品性質(zhì)

外觀：白色粉末

CAS號(hào)：254109-22-3

分子式：C25H18F2N2O7

分子量：496.42

結(jié)構(gòu)式：

 純度：＞98%

保存方法

-25~-15℃保存，有效期2年。

使用說(shuō)明

1、探針母液配置

用新鮮無(wú)水的DMSO溶解相應(yīng)的質(zhì)量的DAF-FMDA至給定濃度。

2、細(xì)胞孵育

1）貼壁細(xì)胞

探針的推薦使用濃度為1-10 µM，初次使用需根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系來(lái)進(jìn)行加載濃度。推薦按照1:1000比例，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA（5 mM），即終濃度為5 µM。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DAF-FM DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常情況下六孔板內(nèi)單孔需要約1 mL的DAF-FM DA工作液，細(xì)胞濃度為1×106-2×107/mL。37℃孵育20 min。之后，PBS洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。

2）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。

按照1:1000比例，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA（5 mM），即終濃度為5 µM。細(xì)胞收集后，用稀釋好的DAF-FM DA重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106-2×107/mL，37℃孵育20 min。上述操作可以在離心管內(nèi)進(jìn)行。每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。PBS洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。直接用適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后再刺激細(xì)胞。

3、檢測(cè)

1）對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡或普通的熒光顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2）對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3）參數(shù)設(shè)置

使用Ex=495 nm，Em=515 nm，實(shí)時(shí)、逐時(shí)間點(diǎn)或單時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DAF-FM和 NO反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜和熒光素（fluorescein）非常相似，可以用檢測(cè)熒光素（fluorescein）的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)，也可用檢測(cè)FITC的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1.對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)（通常為6 h以上）的細(xì)胞，先用適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

2.DAF-FM DA探針的推薦使用濃度為1-10 µM，初次使用需根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系來(lái)進(jìn)行加載濃度，孵育時(shí)間和溫度的優(yōu)化。原則上來(lái)說(shuō)，以最低濃度探針檢測(cè)且產(chǎn)生足量信噪比的熒光信號(hào)為宜。另縮短孵育時(shí)間可減少亞細(xì)胞區(qū)室化現(xiàn)象。

3.以下步驟使用的工作濃度（1:1000倍稀釋，即5 µM）和孵育時(shí)間（37℃，20 min）僅做為參考，可根據(jù)實(shí)際情況來(lái)調(diào)整。比如，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)未被刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可降低DAF-FM DA的加載濃度至1-2.5 µM。相反，如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可升高DAF-FM DA的加載濃度為10 µM，以提高檢測(cè)的靈敏度。另外，探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60 min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，孵育溫度在4℃-37℃內(nèi)調(diào)整。