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3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)檢測(cè)試劑盒（分光光度法50T/48S）
| 貨號(hào) | SH0515 | 售價(jià)（元） | 5040 |
| 規(guī)格 | 50T/48S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0515 |
3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)檢測(cè)試劑盒（分光光度法50T/48S） |
50T/48S |
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SH0516 |
3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)檢測(cè)試劑盒（分光光度法25T/24S） |
25T/24S |
測(cè)定意義：
GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，與糖異生途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機(jī)體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。
測(cè)定原理：
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、無機(jī)磷和NAD，340nm處測(cè)定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0516-25T/24S |
SH0515-50T/48S |
Storage |
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提取液一 |
25ml |
50ml |
4℃ |
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提取液二 |
25ml |
50ml |
4℃ |
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試劑一：粉劑 |
1瓶 |
1瓶 |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
25ml |
50ml |
4℃ |
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試劑三：液體 |
14μl |
28μl |
4℃ |
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說明書 |
一份 |
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自備儀器和用品：
分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
組織樣本的前處理:
①總GAPDH酶提?。航ㄗh稱取約0.1g樣本，加入1ml提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定。
②胞漿和葉綠體GAPDH酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1ml提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿GAPDH酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中GAPDH酶活性。
建議測(cè)定總GAPDH酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理:
先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
（3）在1ml石英比色皿中加入30μL樣本、20μL試劑三和950μL工作液，混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
GAPDH活性計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1072×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=2.144×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。