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測定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質氧化還原反應的酶，催化底物通過細胞色素系統被氧化，釋放的能量供機體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測定原理：

在細胞呼吸過程中，氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈現紅色，于485nm測定其吸光值，即得脫氫酶活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10ml試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現配現用）。

自備儀器和用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。

樣品處理：

1、細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min。

3、液體：直接檢測。

測定步驟：

充分混勻，37℃培養(yǎng)24h：

振蕩1h，8000g，25℃，離心5min，取200μl上清于微量石英比色皿/96孔板，測定A485，△A=A測定-A空白管?？瞻坠苤灰鲆还堋?/span>

脫氫酶活力計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x為標準品濃度（μg/ml），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計算

酶活單位定義：在37℃時，每ml樣本每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /ml）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷V樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）

V反總：反應總體積，1.1ml；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1ml；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.0211x - 0.0312；R² = 0.9988；x為標準品濃度（μg/ml），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計算

酶活單位定義：在37℃時，每ml樣本每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /ml）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷V樣÷T= 0.362×（△A+0.0312）

V反總：反應總體積，1.1ml；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1ml；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml。

注意事項：

配制好的試劑一避光保存于4℃，最好在一周內使用，若出現紅色，則不能使用。