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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                           

測(cè)定意義：

淀粉酶負(fù)責(zé)水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。

測(cè)定原理：

還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐熱。根據(jù)上述特性，鈍化其中之一，就可測(cè)出另一種淀粉酶的活力。

組成：

試劑一：50ml×1瓶，常溫保存，若有黃色晶體析出，需90℃加熱溶解后再用；

試劑二：40ml×1瓶，4℃保存，若有沉淀析出，需70℃加熱后再用。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、玻璃比色皿、研缽和蒸餾水。

粗酶液制備：

組織：稱(chēng)取0.1~0.2g樣本（建議稱(chēng)取約0.1g樣本），加入1ml蒸餾水，研磨勻漿；將勻漿倒入離心管中，提取液在室溫下放置提取15min，每5min振蕩1次，使其充分提取；3000g，25℃離心10min，取上清液加蒸餾水定容至10 ml，搖勻，即淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液1ml，加入4ml蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測(cè)定。

血清（漿）等液體樣本：（1）直接檢測(cè)α-淀粉酶。（2）吸取淀粉酶原液1ml，加入4ml蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一和試劑二40℃預(yù)熱10min。

3、測(cè)定操作表：

70℃水浴15min左右，冷卻

在40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min

混勻，95℃水浴5min，冷卻，在540nm下測(cè)定吸光度，從左到右分別記為A1、A2、A3和A4。

酶活性計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為y=3.7215x -0.1778； x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y為吸光值。

2、α淀粉酶活性

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

α淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中α淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α淀粉酶活性(mg/min/ml)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T=0.1075×(A2-A1＋0.1778)

3、總淀粉酶活性計(jì)算

（1）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min//g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中總淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

總淀粉酶活性(mg/min/ml) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778)

4、β-淀粉酶活性計(jì)算

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A3＋0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中β-淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/ml）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)

5：總淀粉酶稀釋倍數(shù)；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25 ml；V樣總：提取液總體積，10 ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。