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測(cè)定意義：

TH位于線(xiàn)粒體的內(nèi)膜上，又稱(chēng)為呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體六，催化NADH+NADP⁺和 NAD⁺+NADPH相互轉(zhuǎn)化。催化正向反應(yīng)稱(chēng)為TH-1。線(xiàn)粒體NADH含量增加時(shí)會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜的H+電化學(xué)梯度升高，因而促進(jìn)了電子傳遞鏈上ROS的產(chǎn)生。TH-1促進(jìn)NADH轉(zhuǎn)換為NADPH，從而提高線(xiàn)粒體的抗氧化能力。

測(cè)定原理：

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代NADP⁺，TH-1催化 APADP⁺還原生成的APADPH在375nm有特征光吸收，因此通過(guò)測(cè)定375nm光吸收增加速率，來(lái)計(jì)算TH-1活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g，4℃離心5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、上清液即為除去線(xiàn)粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線(xiàn)粒體泄漏的TH-1（此步可選做）。

5、步驟4中的沉淀即為線(xiàn)粒體，加入500uL試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于TH-1活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至375nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）工作液的配制：臨用前取試劑三、試劑四和試劑五各一支，將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在1mL玻璃比色皿中加入100μL樣本和1000μL工作液，混勻，立即記錄375nm處初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

TH-1活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

 TH-1活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣)÷T=164×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=82×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=0.164×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.1×10-3 L；ε：APADPH摩爾消光系數(shù)，6.7×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。