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丙酮酸脫氫酶（PDH）檢測(cè)試劑盒（微量法100T/96S）
| 貨號(hào) | SH0233 | 售價(jià)（元） | 1740 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0233 |
丙酮酸脫氫酶（PDH）檢測(cè)試劑盒（微量法100T/96S） |
100管/96樣 |
測(cè)定意義：
PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。
測(cè)定原理：
PDH催化丙酮酸脫氫，同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0233-100T/96S |
Storage |
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試劑一：液體 |
100ml |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
20ml |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
1.5ml |
-20℃ |
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試劑四：液體 |
20ml |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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說明書 |
一份 |
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自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PDH活性測(cè)定。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入19ml試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本和190μl試劑五，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
PDH活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。