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α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）檢測(cè)試劑盒（微量法 100T/96S）
| 貨號(hào) | SH0231 | 售價(jià)（元） | 1740 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱(chēng) |
規(guī)格 |
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SH0231 |
α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）檢測(cè)試劑盒（微量法 100T/96S） |
100管/96樣 |
測(cè)定意義：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動(dòng)物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。
測(cè)定原理：
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
組成：
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產(chǎn)品名稱(chēng) |
SH0231-100T/96S |
Storage |
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試劑一：液體 |
100ml |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
20ml |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
1.5ml |
-20℃ |
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試劑四：液體 |
20ml |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1瓶 |
-20℃ |
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試劑六：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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說(shuō)明書(shū) |
一份 |
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自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體α-KGDH活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入18ml試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；
（2）在試劑六中加入1ml蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、10μl試劑六和180μl試劑五，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
α-KGDH活性計(jì)算：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
α-KGDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
α-KGDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
α-KGDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
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