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測(cè)定意義：

纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，研究濾紙酶活力對(duì)纖維素酶的研究具有非常重要的意義。

測(cè)定原理：

濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測(cè)定計(jì)算得濾紙酶的活力。

組成：

自備儀器和用品：

天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提取：

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1ml蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于4℃，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：蒸餾水體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和Ep管，每支Ep管中放入一個(gè)卷狀濾紙條（注意要放入底部），作為底物。

2. 對(duì)照管：取200μl滅活的酶液，加入500μl試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中，標(biāo)注為對(duì)照管。

3. 測(cè)定管：取200μl酶液，加入500μl試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中，標(biāo)注為測(cè)定管。

4. 對(duì)照管和測(cè)定管同時(shí)置于50℃水浴鍋中反應(yīng)30min。

5. 加入800μl試劑二，沸水浴5min，自來(lái)水冷卻后取200μl于微量石英比色皿/96孔板中測(cè)定540nm處吸光值，分別記為A對(duì)照管和A測(cè)定管，△A= A測(cè)定管- A對(duì)照管。

酶活性計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.2805x - 0.0255，R² = 0.9991

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                = 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

             = 0.891×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷V樣÷T

            = 0.891×（△A+0.0255）

（4）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷V樣總）÷T

               = 0.891×（△A+0.0255）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

V反總：反應(yīng)總體積，1.5ml，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.1403x - 0.0255，R² = 0.9991

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                =1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

          = 1.782×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷V樣÷T

            = 1.782×（△A+0.0255）

（4）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷V樣總）÷T

               = 1.782×（△A+0.0255）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

V反總：反應(yīng)總體積，1.5ml，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

1. 用干凈的鑷子取出濾紙條，帶手套卷成卷放入Ep管底部。

2. 樣本滅活時(shí)保證同一批樣本處理時(shí)間一致，建議沸水浴十分鐘。

3. 批量樣本測(cè)定之前先做1-2個(gè)樣本的預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值超過(guò)1.2，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

顯色后取檢測(cè)液時(shí)注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物，影響測(cè)定結(jié)果