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測定意義：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

測定原理：

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

組成：

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1ml玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量

（10⁴個）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；

8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，

加入1ml試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定（在EP中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴1 小時

混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在EP管中加入下列試劑

混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

注意：

1、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A測定管-A對照管）若出現(xiàn)負值，可能是酶活性較低，可將反應時間1h延長到2h，相應的在計算公式中除以2。

酶活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為y =3.8488x +0.0057，R² = 0.9983；；x為標準品濃度（μmol/ml），y為吸光值A。

1、血清（漿）GLS活性

單位定義：每ml血清（漿）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS（nmol /min /ml）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反總÷V樣÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)

 2、組織、細菌或細胞GLS活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg蛋白質(zhì)每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol /min /mg prot）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每g組織每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol/min/g 鮮重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000

=181.8×(ΔA -0.0057)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS（nmol/min/104 cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反總÷(500× V樣÷V樣總)÷T×1000

=0.3637×(ΔA-0.0057)

V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，60min；V反總：反應體系總體積，1.05ml；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.025ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬; 1000，μmol到nmol換算系數(shù)。