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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時(shí)，形成大量的 ROS，同時(shí) NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測(cè)定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH，NADH 通過 PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測(cè)吸光值；而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測(cè)。

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存，用時(shí)加入 4ml 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時(shí)加入 4ml 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

NAD+和 NADH 的提取 ：

1、 血清（漿）中 NAD+和 NADH 的提取

NAD+的提取：按照血清（漿）體積（ml）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建

議取約 0.1ml 血清（漿），加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；

冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中

和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADH 的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建

議取約 0.1ml 血清（漿），加入 1ml 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；

冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中

和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、 組織中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g

組織，加入 1ml 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴

中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADH 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g

組織，加入 1ml 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴

中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，

混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性

提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 酸性提取液），

超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min

（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加

入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：堿

性提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 堿性提取液），

超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min

（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加

入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 加樣表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，570nm下比色，讀取對(duì)照吸光值A1和測(cè)定管吸光值A2，計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加

試劑六；測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NAD+測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0222，已低

于檢測(cè)限，可做如下調(diào)整：（1）將測(cè)定管避光靜置時(shí)間 20min 延長到 60min；（2）在提取

階段增加取樣量，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒 50 管保證測(cè) 24 個(gè) NAD+或 NADH.。

NAD+和 NADH 含量的計(jì)算：

（一） NAD+含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.295x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 為△A，x 為 NAD+濃度

nmol/ml

1、血清（漿）中 NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=67.8×(△A -0.0302）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)= 6.8×(△A -0.0302）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0302）

（二）NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.2808x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 為△A，x 為 NADH 濃

度 nmol/ml

1、血清（漿）中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 71.2×(△A -0.0222）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)= 3.6×(△A -0.0222）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 7.1×(△A -0.0222）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0222）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）

體積：0.1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，

500 萬。

注意：最低檢測(cè)限為 0.1nmol/ml 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot