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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

TAL廣泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。TAL能夠躍過肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）直接將酪氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酸，香豆酸可進(jìn)一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素類天然產(chǎn)物。

測(cè)定原理：

TAL能夠分解酪氨酸產(chǎn)生香豆酸，使反應(yīng)溶液333nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而上升，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出TAL活性。

組成：

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5ml蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）果汁等液體樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二的配置：臨用前在試劑二瓶中加入15ml試劑一充分溶解待用（用不完的試劑4℃保存一周，注意現(xiàn)配現(xiàn)用），在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、在EP管中依次加入如下試劑

混勻，10000g4℃離心5min，取0.8~1ml上清至1ml石英比色皿，333nm下測(cè)定吸光值A測(cè)定與A對(duì)照，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照

TAL活性計(jì)算：

1、血清（漿）或果汁TAL活性

單位的定義：每分鐘每ml血清（漿）或果汁在每ml反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化

0.01為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/ml）=ΔA×V反總÷( V樣÷V樣總)÷0.01÷T =17.5×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞TAL活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

TAL（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =17.5×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每ml反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

TAL（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =17.5×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每ml反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =0.035×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.05ml；V樣：加入樣本體積，0.1ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。