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正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義：

花色苷是一類易溶于極性溶劑的天然色素，屬黃酮類化合物?；ㄉ諒V泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中，使其呈現(xiàn)由紅到紫等不同顏色，是植物主要的呈色物質(zhì)。

測定原理：

采用pH示差法測定花色苷含量，當pH為1.0時花色苷在530nm處有最大吸收峰,而當pH為4.5時,花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色查爾酮形式,在530處無吸收峰, 利用此特性分別測定在不同pH下的530nm和700nm處的吸光度值。pH示差法減少了溶液pH和溶劑差異的影響，排除了其他非花色苷類物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾。

試劑的組成和配制：

需自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

花色苷的提?。?/span>

按照烘干樣品質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g烘干樣品，加入1ml提取液），充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中，提取液定容至1 ml，蓋緊后4℃浸提24 h，8000 g，常溫離心10 min，取上清液待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上；試劑一和試劑二25℃（室溫）預(yù)熱10min以上；

2、取20 μl上清液和180 μl試劑一（相當于稀釋10倍），40℃水浴20min，分別測定530nm和700nm處的吸光值，分別記為A1和A2。

3、 取20 μl上清液和180 μl試劑二（相當于稀釋10倍），40℃水浴20min，分別測定530nm和700nm處的吸光值，分別記為A3和A4。

4、 計算△A=(A1-A2)-(A3-A4)

注意：

如果A1大于1，可以適當加大稀釋倍數(shù)，保證總體積200 μl不變，如10 μl上清液和190 μl試劑一（相當于稀釋20倍）；如果A1小于0.1，可以適當縮小稀釋倍數(shù)，保證總體積不變，如100 μl上清液和100 μl試劑一（相當于稀釋2倍），使A1保持在0.1~1范圍內(nèi)，可提高檢測靈敏度；同樣調(diào)整上清液和試劑二體積比例；計算時以實際稀釋倍數(shù)代入下述公式中。

花色苷含量計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

花色苷含量（μg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=16.7×ΔA× F÷W

V：提取液體積，1×10-3L；ε：花色苷的摩爾消光系數(shù)，2.69×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；M：花色苷的相對分子質(zhì)量：449.2g/mol；F：稀釋倍數(shù)；106：1g=106μg；W：樣本干重：g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

花色苷含量（μg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=33.4×ΔA× F÷W

V：提取液體積，1×10-3L；ε：花色苷的摩爾消光系數(shù)，2.69×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；M：花色苷的相對分子質(zhì)量：449.2g/mol；F：稀釋倍數(shù)；106：1g=106μg；W：樣本干重：g。

ΔA線性范圍為0.005-0.5。