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正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。

測定原理：

PPO能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在525nm有特征光吸收。

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體積（ml）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議取0.1ml血清（漿）或果汁加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至525nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）中準確水浴10min后，95℃水浴5min，冷卻至室溫，10000g，25℃離心10min，收集上清，取200μl至微量石英比色皿或96孔板中，525nm處檢測測定管和對照管吸光度，計算ΔA=A測定-A對照。

注意：煮沸樣本的操作：取300μl離心上清于EP管中，進行5min 95℃水浴處理；每個測定管需要設(shè)一個對照管，可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進行5min 95℃水浴處理。

PPO活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每ml血清（漿）或果汁在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化

0.01為一個酶活力單位。

PPO（U/ml）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液

2、組織、細菌或細胞PPO活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個

酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每g組織在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個

酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3ml；V液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每ml血清（漿）或果汁在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化

0.005為一個酶活力單位。

PPO（U/ml）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液

2、組織、細菌或細胞PPO活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個

酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每g組織在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個

酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每ml反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.24×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3ml；V液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。