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產(chǎn)品描述

Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的體外 RNA 轉(zhuǎn)錄試劑盒，可高效進(jìn)行 Cas9 sgRNA 的制備。使用本試劑盒時(shí)，僅需按照本試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)并合成 Target Sense Oligo，每次反應(yīng)可獲得 50-150 μg 的 Cas9 sgRNA。獲得的 Cas9 sgRNA 可應(yīng)用于 CRISPR 分子診斷、基因編輯等。

產(chǎn)品組分

Part A：體外轉(zhuǎn)錄試劑（-20℃保存）	31902-01（25 T）	31902-02（50 T）
● 5 × TranscriptMax Reaction Buffer	100 μL	200 μL
● NTP mix	200 μL	400 μL
● TranscriptMax Enzyme Mix	55 μL	110 μL
○ DEPC-treated Water	1 mL	1 mL
● 2 × PCR Master Mix	250 μL	500 μL
● Cas9 Antisense Oligo	25 μL	25 μL
● Cas9 Control Target Sense Oligo a	25 μL	25 μL
● 2 × DNase Ⅰ Buffer	625 μL	1250 μL
● DNase Ⅰ	100 μL	200 μL

 

Part B：純化磁珠（4℃保存）	3620F-01（25 T）	3620F-02（50 T）
● Magnetic Beads b	625 μL	1250 μL

a. Cas9 Control Target Sense Oligo 是陽(yáng)性對(duì)照，可與 Cas9 Antisense Oligo 退火延伸后，作為轉(zhuǎn)錄模板使用，用來(lái)測(cè)試體外轉(zhuǎn)錄體系的效率。在 37℃孵育 30 min 條件下，對(duì)照轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系生成的 sgRNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由NanoDrop 測(cè)定。在變性條件下進(jìn)行 TBE-Urea gel 電泳，可觀察到 sgRNA 單條帶大小約為 100 nt。

b. 本產(chǎn)品中 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）與 Part A 組分保存條件不同，因此 Part B 組分需單獨(dú)運(yùn)輸！

保存條件

Part A 組分-20℃保存，有效期 1 年。

需自備的實(shí)驗(yàn)物品

PCR 儀

無(wú)水乙醇

異丙醇

無(wú)核酸酶水

96 孔磁力架

96 孔板或 PCR 8 聯(lián)排管

移液器及吸頭

Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)

1.Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖如圖 1 所示，試劑盒中已提供 Cas9 Antisense Oligo，只需根據(jù)待測(cè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì) Target Sense Oligo 即可。

 

圖 1. Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

 

2.Target Sense Oligo 設(shè)計(jì)舉例

2.1 選取 20 bp 的 Target Sequence，其中方框部分為 PAM 序列，下劃線部分為 Target Sequence。

 

 

2.2 根據(jù)選取的 Target Sequence 設(shè)計(jì) Target Sense Oligo，則其序列應(yīng)為：

 

其中雙下劃線為保護(hù)堿基，波浪線部分為 T7 Promoter 序列，下劃線部分為 Target Sequence反向互補(bǔ)序列，如果 Target Sequence 反向互補(bǔ)序列第一個(gè)字母是 G 堿基，則可以和 T7 Promoter 序列共用一個(gè) G 堿基。下劃虛線部分為 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。

 

2.3 轉(zhuǎn)錄得到的 Cas9 sgRNA 序列應(yīng)為：

 

下劃線部分為 Target Sequence反向互補(bǔ)序列，波浪線部分為 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。

實(shí)驗(yàn)流程

1.DNA 轉(zhuǎn)錄模板制備

Cas9 Antisense Oligo 與 Target Sense Oligo 退火延伸反應(yīng)完成后便可作為轉(zhuǎn)錄模板使用。

1.1 退火體系配制

組分	體積
2 × PCR Master Mix	10 μL
Cas9 Antisense Oligo (10μM)	0.5 μL
Target Sense Oligo (10μM)	0.5 μL
DEPC-treated Water	9 μL

1.2 PCR 退火延伸程序設(shè)置

溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
95℃	2 min	× 1
95℃	15 s	× 5
55℃	15 s
72℃	10 s
25℃	Hold on

 

2.Cas9 sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄

2.1 按下表試劑的順序進(jìn)行反應(yīng)體系的配制。

組分	體積
5 × TranscriptMax Reaction Buffer	4 μL
NTP mix	8 μL
TranscriptMax Enzyme Mix	2.1 μL
DEPC-treated Water	0.9 μL
DNA 轉(zhuǎn)錄模板	5 μL

· 請(qǐng)將試劑解凍并完全混勻后再使用。

· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺，而亞精胺與核酸容易形成復(fù)合體沉淀，DNA 轉(zhuǎn)錄模板盡量最后加入到體系中。

· 上述反應(yīng)體系的總體積為 20 μL，可適當(dāng)?shù)缺壤{(diào)整反應(yīng)體系。

2.2 將上述試劑充分混勻，然后短暫離心，在 37℃下孵育 0.5-1 h 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2.3 37℃孵育結(jié)束后，按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反應(yīng)液加入到 20 μL 的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，以去除轉(zhuǎn)錄體系中的 DNA 模板。

組分	體積
2 × DNase Ⅰ Buffer	25 μL
DNase Ⅰ	4 μL
DEPC-treated Water	1 μL

DNase Ⅰ反應(yīng)條件：37℃，30 min。

3.Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物磁珠純化

3.1 首先將磁珠從 4℃冰箱中取出，在室溫中放置約 30 min，使其溫度平衡至室溫。顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻，吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 異丙醇加入到 50 μL 待純化的 sgRNA 樣品中，用移液器吹打充分混勻。

3.2 室溫孵育 5 min，使 RNA 結(jié)合到磁珠上。

3.3 將樣品置于磁力架上 5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。

3.4 保持樣品置于磁力架上，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇,漂洗磁珠，室溫孵育 30 s，小心移除上清。

注：漂洗時(shí)使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鮮配制，配制方法舉例如下：分別量取8 mL 無(wú)水乙醇和 2 mL Nuclease-free water，混勻后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重復(fù)步驟 4，共漂洗 2 次。

3.6 保持樣品始終處于磁力架上，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠 5 min。

注：磁珠開(kāi)蓋晾干時(shí)要避免過(guò)分干燥，如果磁珠出現(xiàn)龜裂，則提示磁珠過(guò)分干燥，此時(shí) RNA 的洗脫效率會(huì)降低。

3.7 將樣品從磁力架上取出，加入 50 μL Nuclease-free water，用移液器吹打以充分混勻，室溫靜置 5 min。

3.8 將樣品置于磁力架 5 min，待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)新的 Nuclease-free PCR 管中，即得到純化后的 Cas9 sgRNA。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒制備的 sgRNA 為目前最常用的 SpCas9 sgRNA，如果要制備其它類型的 Cas9 sgRNA，只需要根據(jù) Cas9 sgRNA scaffold 序列重新設(shè)計(jì) Target Sense Oligo 與 Cas9 Antisense Oligo 即可。

2. 本試劑盒中的 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）單獨(dú)運(yùn)輸。磁珠保存條件為 2-8℃，嚴(yán)禁凍存和高速離心操作。

3. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會(huì)顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，導(dǎo)致 RNA 合成量減少。

4. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)選用無(wú)核酸酶的槍頭和離心管。