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產(chǎn)品信息

      牛痘病毒加帽體系利用牛痘病毒加帽酶及相關組分，將 7-甲基鳥苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結構與 mRNA 的穩(wěn)定、轉運和翻譯密切相關。使用酶促反應為 RNA 加帽是一種簡單有效的方法，且帽結構與天然Cap 0 結構完全一致，能顯著改善用于體外轉錄、轉染和顯微注射的 RNA 的穩(wěn)定性和翻譯能力。這種酶由兩個亞基（D1 和D12）組成 （圖 1a），D1 亞基執(zhí)行 RNA 三磷酸酶和鳥苷轉移酶的功能，D12 亞基執(zhí)行鳥嘌呤甲基轉移酶的功能，它們對于添加一個完整的 Cap 0 結構 m7Gppp5′N 都是必須的（圖 1b）。 

a.  b.  

圖1. 牛痘病毒加帽的結構和作用機理。a. 牛痘病毒加帽酶和 GTP（紅色）、SAH（玫紅）的共結晶結構 (PDB 4CKB) 。該酶由 D1 和 D12 兩個亞基組成，兼具RNA 三磷酸酶（藍色）、鳥苷轉移酶（橙色）和鳥嘌呤甲基轉移酶（米黃色）的功能。本圖引自 Ramanathan, A., Robb, G. B., & Chan, S. H. (2016). mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 44(16), 7511–7526. b. mRNA 的帽結構是由一個 7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0 結構由相鄰的 RNA 鏈通過三種酶的依次反應形成。進一步形成 cap-1 結構需要2’-O-甲基轉移酶的參與，該修飾可以降低 RNA 在體內引起的細胞先天免疫反應。本圖引自 Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。 
     本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應，使加帽反應在 1h 之內完成，效率接近 100%，并且保證正確的方向。IVT 推薦使用近岸蛋白質 T7 High Yield RNA Transcription kit（貨號：E131）。 
產(chǎn)品用途：
      體內或體外翻譯前 mRNA的加帽和 mRNA的 5’末端標記。     
注意事項：   
     SAM：需事先計算好 SAM 的用量，在反應開始前把分裝的 32 mM 的儲備液稀釋成 2 mM 的工作液。SAM 在 pH 7-8，37°C條件下不穩(wěn)定，需要在反應開始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。 
     RNA：在加帽體系使用之前，應將體外轉錄反應產(chǎn)生的 RNA 進行純化并溶解于 RNase-free 水中，不能將 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他鹽溶液中。 
     RNA 二級結構：一些 RNA 轉錄本可能形成穩(wěn)定的二級結構（同源二聚體和發(fā)卡結構），如二級結構發(fā)生在轉錄本的 5'端會影響加帽效率。在與加帽酶反應之前加熱 RNA 可以去除轉錄產(chǎn)物 5′端的二級結構，如果轉錄產(chǎn)物的 5′端結構復雜，可以把加熱時間延長至 10min，加帽反應時間可延長至 60min。 
     Cap 0-和 Cap 1-mRNA：Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端緊鄰帽結構的第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核細胞中，該甲基化是天然加帽過程的一部分，Cap 1 結構提高了 mRNA 的翻譯效率。 


      近岸蛋白質 Vaccinia Capping System 可以與 mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase（貨號：M072）在一個體系內同時工作產(chǎn)生Cap 1 結構。當使用新的細胞系或翻譯系統(tǒng)時，建議比較 Cap 0-和 Cap 1-mRNA 翻譯效率和免疫原性，以確定最佳的帽子結構。 
Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白質 E. coli Poly(A) Polymerase（貨號：M012）進行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進行 RNA 轉染實驗前做純化處理。 
      RNase Inhibitor：在配置反應體系時，可以加入 0.5 μl 近岸蛋白質 RNase 抑制劑（貨號：E125），同時去掉等體積的 RNase-free 水。 
      RNA5’端標記：在用于 RNA 5′端標記時，GTP 儲備液應稀釋到 mRNA 濃度的 1-3 倍。 
For research and manufacturing use only.