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SUPERSWITCH? RACE cDNA Synthesis Kit
| 貨號(hào) | ST0011S | 售價(jià)（元） | 7800 |
| 規(guī)格 | 5T | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
SUPERSWITCH?RACE cDNA Synthesis Kit
I.簡介
SUPERSWITCH? RACE cDNA合成試劑盒通過擴(kuò)增基因的5'和3'末端精細(xì)、有效地完整克隆基因。SUPERSWITCH? RACE方法可有效地在樣品cDNA 5 '和3 '末端加入人工接頭，盡可能地形成最完整的RACE產(chǎn)物。反轉(zhuǎn)錄步驟后合成的第一鏈cDNA可直接用于5'和3' RACE PCR反應(yīng)，無需再進(jìn)行繁復(fù)的第二鏈cDNA合成和接頭連接的過程。其他RACE方法均因擴(kuò)增的高背景和截短的5 '末端而存在明顯的劣勢(shì)。優(yōu)化后的方法既便是在樣本很小的情況下，也可以顯著降低非特異性的擴(kuò)增，且只需單一PCR管和兩步法的程序就可使您的RNA樣品合成cDNA。
此外，SUPERSWITCH?技術(shù)由于避免了接頭連接的步驟，在RACE PCR過程中直接使用cDNA作為模板，從而降低了RACE的過程的復(fù)雜性，并使其更快捷（Chenchik et al，1998），操作時(shí)間更縮短至4個(gè)小時(shí)。
SUPERSWITCH? PCR RACE Kit也對(duì)PCR過程也進(jìn)行了優(yōu)化，增加RACE反應(yīng)的靈敏性的同時(shí)，降低了試驗(yàn)背景。因此，試驗(yàn)者可用很少的mRNA或是總RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板來構(gòu)建全長cDNA。
II. SUPERSWITCH? cDNA 合成技術(shù)
通常cDNA的合成方法均通過逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄）將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈的單鏈cDNA（single-stranded cDNA，ss cDNA）。受限于反轉(zhuǎn)錄的效率，基因的5'端在反轉(zhuǎn)錄過程中常常不能被轉(zhuǎn)錄，最終形成的cDNA的5'端通常并不完整。在基因序列較長、mRNA連續(xù)出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是僅以oligo（dT）引物合成第一鏈cDNA的情況下，5'端cDNA鏈合成截短的現(xiàn)象尤為突出。以未降解的RNA構(gòu)建的cDNA文庫中，出現(xiàn)的截短的cDNA的分子常因反轉(zhuǎn)錄過程異常終止所致。但無論如何，SUPERSWITCH?方法能夠優(yōu)先富集的全長cDNA片段。
第一鏈cDNA合成由優(yōu)化的oligo（dT）引物起始。反轉(zhuǎn)錄至mRNA模板5'末端時(shí)，反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)在cDNA 3'端加入dC殘基。SUPERSWITCH? 5RRT引物與cDNA 3'端加入dC殘基間的退火為SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase的反轉(zhuǎn)錄提供了可供延伸的模板。
III.操作簡述
1.引物設(shè)計(jì)（詳見第Ⅵ節(jié)A）
無論是5'-RACE和（或）3'-RACE反應(yīng)都必須要設(shè)計(jì)基因特異性引物（gene-specific primers，GSP），分別命名為GSP1和GSP2。各自的巢式PCR基因特異性引物(NGSP1和NGSP2)可用于RACE產(chǎn)物的分析。在某些情況下，這些巢式的引物也可用于RACE PCR反應(yīng)。第Ⅵ節(jié)中會(huì)詳述引物設(shè)計(jì)的方法。圖2顯示了SUPERSWITCH? RACE反應(yīng)中所使用的引物與其序列來源的相對(duì)關(guān)系。
2.第一鏈cDNA合成（詳見第Ⅷ節(jié)）
SUPERSWITCH? RACE Kit可以合成兩種類型的cDNA——5'-RACE用的cDNA和3'-RACE用的cDNA，但只有5'-RACE用的cDNA 具有延長的5'末端。5'-RACE用的cDNA是以改進(jìn)過的錨定oligo（dT）引物和SUPERSWITCH? 5RRT反轉(zhuǎn)而成。改進(jìn)過的錨定oligo（dT）引物名為SUPERSWITCH? 3RRT1，在其3'端有兩個(gè)兼并的核苷酸。這些兼并核苷酸位于poly A+尾的前兩位，與經(jīng)典的oligo（dT）引物相比可降低3'結(jié)合的非均質(zhì)性（Borson et al ，1992）。3'-RACE用的cDNA則以特殊的oligo（dT）引物在傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄程序下反轉(zhuǎn)而成。
3.RACE PCR反應(yīng)（詳見第IX節(jié)）
只要使用不同的基因特異性引物，反轉(zhuǎn)錄后的RACE用cDNA就可用于多個(gè)基因的5'-和3'-RACE擴(kuò)增。SUPERSWITCH? RACE操作體系中附帶的SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase（BT0012）是重組Taq DNA聚合酶和其抗體的混合物，Taq DNA聚合酶具有3′至5′核酸外切酶的活性，大幅提高了PCR擴(kuò)增的保真度；而添加的Taq DNA聚合酶抗體則提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和產(chǎn)量。經(jīng)PCR條件優(yōu)化后可擴(kuò)增長度達(dá)12～20 kb的片段。因此，SUPERSWITCH? Hot Start PCR Kit可高效、便捷、精確地以cDNA為模板進(jìn)行長距離PCR（long distance PCR，LD PCR）（Barnes, 1992；Cheng et al 1994），適于高保真地?cái)U(kuò)增復(fù)雜或高GC含量的模板。
4.鑒定RACE產(chǎn)物（詳見第Ⅹ節(jié)）
在構(gòu)建全長cDNA*前，強(qiáng)烈建議通過以下步驟確認(rèn)目的序列：(1) GSP1和SUPERSWITCH? 5AP、NGSP1和SUPERSWITCH? 5AP兩種PCR產(chǎn)物的比較；(2)以內(nèi)部序列（如NGSP1）標(biāo)記的引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot分析；(3) 對(duì)RACE產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，至少獲得部分的序列信息。
*“全長”cDNA：沒有任何一種cDNA合成的方法可以保證一定得到全長的cDNA，尤其是5'末端。確定5'末端的真實(shí)性需要結(jié)合RNase保護(hù)分析、引物延伸分析和/或cDNA或是基因組的序列信息。大多數(shù)的SUPERSWITCH? RACE cDNA包括具有全長的5'末端的cDNA，但是在某些情況下如果具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA或是cDNA將會(huì)阻斷反轉(zhuǎn)錄或PCR過程。與傳統(tǒng)RACE或是文庫的方法獲得的cDNA相比，SUPERSWITCH? RACE全長cDNA的比例更高。為了最大限度獲得序列的5'末端，在進(jìn)行5'- RACE試驗(yàn)的時(shí)候，至少測(cè)序的克隆數(shù)為5~10個(gè)。
即使是兩次RACE反應(yīng)均為單一產(chǎn)物，上述對(duì)RACE產(chǎn)物的定性試驗(yàn)也可以避免在之后的試驗(yàn)中浪費(fèi)您的時(shí)間，或是導(dǎo)致試驗(yàn)的假陽性。在發(fā)現(xiàn)有多條基因的RACE產(chǎn)物，或是克隆的目的基因?yàn)槟硞€(gè)基因家族的某一成員的情況下，這些試驗(yàn)對(duì)得到正確的結(jié)果尤為重要。
IV.SUPERSWITCH?試劑盒組分
所有試劑均保存于-20℃。需要注意的是SUPERSWITCH? RACE cDNA 合成試劑盒分為動(dòng)物來源（ST0011）、植物來源（ST0091）和具polyA尾的RNA病毒（ST0111）3種不同規(guī)格，請(qǐng)根據(jù)試驗(yàn)樣品購買相應(yīng)的試劑盒，以達(dá)到最好的試驗(yàn)效果！
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目的 |
試劑 |
ST0011/ ST0091/ ST0111 |
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S/5次 |
L/10次 |
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反 轉(zhuǎn) 錄 |
1 |
●SUPERSWITCH? 3RRT1 Oligonucleotide |
6μL |
12 μL |
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2 |
●SUPERSWITCH? 3RRT2 Oligonucleotide |
6μL |
12 μL |
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3 |
●dNTP Mix (10 mM) |
20 μL |
40 μL |
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4 |
●Deionized H2O |
100 μL |
100 μL |
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5 |
●5X First-Strand Buffer (RNase-Free) |
30 μL |
60 μL |
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6 |
●SUPERSWITCH? BufferⅠ |
5 μL |
10 μL |
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7 |
●SUPERSWITCH? BufferⅡ |
5 μL |
10 μL |
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8 |
●RNase Inhibitor (40 U/μL) |
6 μL |
12 μL |
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9 |
●SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase (200 U/μL) |
6 μL |
12 μL |
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10 |
●SUPERSWITCH? 5RRT Oligonucleotide |
6 μL |
12 μL |
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PCR |
11 |
●5AP PCR Primer (12 μM) |
30 μL |
60 μL |
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12 |
●3AP PCR Primer (12 μM) |
30 μL |
60 μL |
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13 |
●10×SUPERSWITCH? Hot Start Buffer |
100 μL |
200 μL |
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14 |
●dNTP Mix (2.5 mM of each dNTP) |
200 μL |
400 μL |
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15 |
●SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase（5U/μL） |
10 μL |
20 μL |
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1．cDNA合成部分
? SUPERSWITCH? 5RRT：用于cDNA 3'接頭（對(duì)應(yīng)mRNA 5'端）引物的跳轉(zhuǎn)；
?SUPERSWITCH? 3RRT1：用于起始第一鏈cDNA合成；
?SUPERSWITCH? 3RRT2：用于起始第一鏈cDNA合成，該引物帶有cDNA 5'接頭（對(duì)應(yīng)mRNA 3'端）；
2．PCR擴(kuò)增部分
? SUPERSWITCH? 5AP：為SUPERSWITCH? 5RRT的部分序列，用于基因的5' RACE試驗(yàn)
? SUPERSWITCH? 3AP：為SUPERSWITCH? 3RRT的部分序列，用于基因的3' RACE試驗(yàn)
. Ⅴ 注意事項(xiàng)
1．SUPERSWITCH? 技術(shù)所需的模板跳轉(zhuǎn)過程需要使用M-MuLV RNase H—點(diǎn)突變的反轉(zhuǎn)錄酶。SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase是一種遺傳修飾的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，該酶具有RNA和DNA依賴的聚合酶活性，但是缺乏RNase H活性（該活性區(qū)域點(diǎn)突變），不能降解第一鏈cDNA合成時(shí)形成的RNA-DNA復(fù)合物中的RNA，因而可獲得全長的cDNA。在42~55℃范圍內(nèi)SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase均有酶活性，因此適合逆轉(zhuǎn)錄具有較多二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA分子。
2．SUPERSWITCH?試劑盒所優(yōu)化的操作步驟適用于總RNA和mRNA模板。第一鏈cDNA合成所需的最小起始量為50 ng的總RNA或是25 ng的mRNA。但是如果樣品RNA的取材不受限制，我們強(qiáng)烈建議以1 μg的總RNA或是0.5 μg的mRNA起始第一鏈的cDNA合成。
3．無論您以何種目的使用該試劑盒，試驗(yàn)的成功與否取決于起始樣品的總RNA或mRNA的質(zhì)量。
4．在進(jìn)行第一鏈cDNA合成前，我們強(qiáng)烈推薦以甲醛/EtBr/瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性的檢測(cè)。哺乳動(dòng)物的總RNA 28S和18S帶電泳條帶接近于4.5 kb和1.9 kb分子量的Marker。28S與18S的比值接近于1.5~2.5：1。完整的哺乳動(dòng)物mRNA電泳顯示為分布于0.5~12 kb間的彌散條帶，并伴有微弱的28S和18S rRNA條帶。非哺乳動(dòng)物（如植物、昆蟲、酵母和兩棲動(dòng)物）的mRNA電泳則可能在0.5~3 kb間彌散分布。
5．操作過程中佩戴口罩和手套可降低RNA和cDNA樣品被核酸酶降解的風(fēng)險(xiǎn)。
6．本操作過程中的循環(huán)參數(shù)設(shè)置已在自動(dòng)熱蓋的PCR儀中反復(fù)優(yōu)化，但是仍需根據(jù)您的PCR儀和模板優(yōu)化試驗(yàn)循環(huán)參數(shù)的設(shè)置。
7．為使PCR反應(yīng)管中的試劑混合均勻，須輕柔吸打溶液，并瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液沉積于PCR反應(yīng)管底部。
8．未注明的情況下，所有操作均在冰上進(jìn)行。
9．反應(yīng)體系中的酶需要最后添加，并輕柔吸打溶液，使酶與反應(yīng)體系中的其他組分充分混勻。
10．由于反應(yīng)體系中的各組分均經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，酶和模板的量請(qǐng)勿隨意增減。
11．RACE PCR的有效性取決于RNA樣品中您的目的基因的表達(dá)豐度。此外，不同引物也會(huì)有不同最適的退火和延伸溫度。
VI.引物設(shè)計(jì)1.引物設(shè)計(jì)
基因特異性引物（Gene-Specific Primers，GSPs）應(yīng)該具有以下特征：
? 20~28個(gè)核苷酸；
? 40~70% GC；
? Tm≥50℃。
SUPERSWITCH? RACE反應(yīng)所使用的引物與模板和所得到的RACE產(chǎn)物的關(guān)系見圖2。完整的SUPERSWITCH? RACE操作至少需要2條基因特異性引物——5'-RACE PCR所需的反義鏈引物（GSP1）和3'-RACE PCR 所需的正義鏈引物（GSP2）。如果只做5'-或3'-RACE，設(shè)計(jì)一條GSP及其內(nèi)部的NGSP即可滿足試驗(yàn)要求。引物長度最好是20~25個(gè)核苷酸，避免使用過短或過長的引物。
如圖2所示，基因特異性引物的5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物間最好存在重疊區(qū)。重疊區(qū)內(nèi)如有合適的限制性酶切位點(diǎn)，可以通過酶切和連接反應(yīng)獲得全長的cDNA。若設(shè)計(jì)的兩個(gè)基因特異性引物RACE產(chǎn)物間有100~200 bp的重疊區(qū)，這兩條引物就能用于PCR反應(yīng)的陽性對(duì)照。當(dāng)然，GSP不一定必須有重疊區(qū)。在cDNA較長或豐度較低的情況下，引物最好設(shè)計(jì)在靠近c(diǎn)DNA的末端，兩條引物間可以不存在重疊。此外，引物自身也可以重疊（如互補(bǔ)）。
基因特異性引物GC含量要在40%~70%間，Tm值一般在65℃以上，DNAman軟件melting temperature分析獲得的Hybridization Tm值最好超過50°C（Freier et al，1986）。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，RACE的PCR擴(kuò)增時(shí)，尤其是那些表達(dá)豐度低或有存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)的樣品擴(kuò)增時(shí)，序列較長且Hybridization Tm值超過55°C的引物可以得到更為穩(wěn)定的結(jié)果。此外，設(shè)計(jì)Tm值接近的GSP1和GSP2更有助于SUPERSWITCH? RACE的試驗(yàn)。通過計(jì)算或PCR的溫度梯度試驗(yàn)均能得到GSP1和GSP2的適宜退火溫度。需要注意的是，要避免使用自身帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物。
注意：不要在GSPs的5'末端和/5'和3'末端加入酶切位點(diǎn)，這些附加的序列將增加PCR的反應(yīng)背景。
2.基因內(nèi)引物序列的位置
我們使用SUPERSWITCH? RACE Kit從GSP擴(kuò)增至基因的5' cDNA和3' cDNA末端最長片段的為6 kb。但為了得到較好的結(jié)果，推薦設(shè)計(jì)的GSP到5' cDNA和3' cDNA末端不超過3 kb。
3.GSP的巢式引物
在cDNA制備完畢后的第一次擴(kuò)增時(shí)，不建議使用GSP的巢式引物。GSP和SUPERSWITCH? 5AP或SUPERSWITCH? 3AP一般都會(huì)造成擴(kuò)增的背景。但是以GSP的巢式引物（NGSP1 and NGSP2）作為探針對(duì)RACE產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot分析有助于鑒定RACE PCR產(chǎn)物。此外，初次GSP擴(kuò)增時(shí)，背景較高，或是有非特異性性擴(kuò)增時(shí)，也需要以巢式基因特異性引物進(jìn)行巢式PCR。
如果第一條基因特異性引物和SUPERSWITCH? 5AP或SUPERSWITCH? 3AP擴(kuò)增的結(jié)果為彌散產(chǎn)物，取適當(dāng)體積（1/10~1/1000）利用GSP的巢式引物（NGSP1或NGSP2）和SUPERSWITCH? 5AP或SUPERSWITCH? 3AP進(jìn)行第二次擴(kuò)增。GSP的巢式引物的設(shè)計(jì)也應(yīng)當(dāng)遵循上面的原則。并且GSP的巢式引物不應(yīng)與GSP的序列有重疊。已知的序列本身如果很短，巢式引物3'的序列應(yīng)盡量具有唯一性。
VII.總RNA和m RNA制備與處理
1.一般提示：
? 全程佩戴并經(jīng)常更換手套及口罩，以避免RNA和cDNA的降解！
? 懸浮沉淀或是進(jìn)行溶液混合的過程中，用槍頭輕柔吸打溶液，或是輕彈離心管底部，使其混合均勻?；旌贤戤吅筮M(jìn)行瞬時(shí)離心，保證所有的組份均集中于離心管底部。懸浮沉淀過程中不要使用漩渦混合器混合樣品，避免造成核酸斷裂！
? 未特殊注明的情況下，所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行。
? 反應(yīng)體系中的酶需要最后添加，并保證將酶完全加入已經(jīng)配好的混合物后，輕柔吸打溶液，使酶與反應(yīng)體系中的其他組分充分混勻。
? 由于本試劑盒內(nèi)提供的所有的反應(yīng)體系及試劑均經(jīng)過反復(fù)調(diào)試，因此切勿隨意增減反應(yīng)的試驗(yàn)體系！
? PCR管與吸頭均為一次性使用。
2.RNA分析
在進(jìn)行第一鏈cDNA合成前，我們強(qiáng)烈推薦以甲醛/EtBr/瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性的檢測(cè)。哺乳動(dòng)物的總RNA 28S和18S帶電泳條帶接近于4.5 kb和1.9 kb分子量的Marker。28S與18S的比值接近于1.5~2.5：1。完整的哺乳動(dòng)物mRNA電泳顯示為分布于0.5~12 kb間的彌散條帶，并伴有微弱的28S和18S rRNA條帶。非哺乳動(dòng)物（如植物、昆蟲、酵母和兩棲動(dòng)物）的mRNA電泳則可能在0.5~3 kb間彌散分布。
如果試驗(yàn)樣品的mRNA明顯小于預(yù)計(jì)的大?。ㄈ缧∮?~5 kb），我們建議在確認(rèn)RNA純化試劑未被RNA酶和其他物質(zhì)污染的情況下，重新制備試驗(yàn)樣品所需的RNA。如果新制備的RNA經(jīng)重新檢測(cè)后仍小于預(yù)計(jì)的大小，則需要通過其它的細(xì)胞或組織提取RNA。
VIII.第一鏈cDNA合成
未注明的情況下，所有操作均在冰上進(jìn)行。進(jìn)行說明書中有明確溫度要求的操作時(shí)，應(yīng)該在PCR儀的反應(yīng)模塊溫度與設(shè)置溫度一致后，再將PCR反應(yīng)管放在PCR儀的反應(yīng)模塊上。反應(yīng)體系中的酶需要最后添加，并輕柔吸打溶液，使酶與反應(yīng)體系中的其他組分充分混勻。反應(yīng)體系中的各組分均經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，酶和模板的量請(qǐng)勿隨意增減。
1.每個(gè)樣品及對(duì)照均在200 μL或500 μL PCR反應(yīng)管內(nèi)添加下列組分，吸打混勻，并瞬時(shí)離心。
制備5'-RACE用的cDNA：
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RNA樣品* |
1~6 μL |
1~12 μL |
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●SUPERSWITCH? 3RRT1 Oligonucleotide |
0.5 μL |
1 μL |
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●dNTP Mix(10 mM of each dNTP) |
1.5 μL |
3 μL |
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補(bǔ)足無RNA酶、DNA酶去離子水至總體系 |
8 μL |
16 μL（推薦） |
* (0.025~1 μg mRNA或0.05~5 μg的總RNA)。
制備3'-RACE用的cDNA：
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RNA樣品* |
1~6.5 μL |
1~13 μL |
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●SUPERSWITCH? 3RRT2 Oligonucleotide |
0.5 μL |
1 μL |
|
●dNTP Mix(10 mM of each dNTP) |
1.5 μL |
3 μL |
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補(bǔ)足無RNA酶、DNA酶去離子水至總體系 |
8.5 μL |
17 μL（推薦） |
2. 70℃孵育5 min，立即冰浴3 min。瞬時(shí)離心使溶液收集于PCR反應(yīng)管管底。
3. 在無核酸酶PCR反應(yīng)管中繼續(xù)添加下列組分（注意，添加的組份可配制Mix，也可單獨(dú)添加，但每一組份加入后均需馬上吸打混勻，以保證各組份發(fā)揮最佳的效果?。?/b>。吸打混勻，避免產(chǎn)生氣泡，瞬時(shí)離心收集溶液。
制備5'-RACE用的cDNA：
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●5×SUPERSWITCH? First-Strand Buffer |
2.5 μL |
5 μL |
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●SUPERSWITCH? BufferⅠ |
0.25 μL |
0.5 μL |
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●SUPERSWITCH? BufferⅡ |
0.25 μL |
0.5 μL |
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●RNase Inhibitor |
0.5 μL |
1 μL |
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●SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase |
0.5 μL |
1 μL |
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補(bǔ)足水至總體系 |
至 12 μL |
至 24 μL（推薦） |
42℃孵育30 min后，12.5 μL反轉(zhuǎn)錄體系加入0.5 μL ●SUPERSWITCH? 5RRT Oligonucleotide；25 μL反轉(zhuǎn)錄體系加入1 μL ●SUPERSWITCH? 5RRT Oligonucleotide，吸打混勻，并瞬時(shí)離心，42℃繼續(xù)孵育1 h。
制備3'-RACE用的cDNA：
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●5×SUPERSWITCH? First-Strand Buffer |
2.5 μL |
5 μL |
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●SUPERSWITCH? BufferⅠ |
0.25 μL |
0.5 μL |
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●SUPERSWITCH? BufferⅡ |
0.25 μL |
0.5 μL |
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●RNase Inhibitor |
0.5 μL |
1 μL |
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●SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase |
0.5 μL |
1 μL |
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補(bǔ)足水至總體系 |
至 12.5 μL |
至 25 μL（推薦） |
42℃孵育1 h 30 min。
注意：若使用水浴或無熱蓋的PCR儀進(jìn)行42℃孵育，須在PCR反應(yīng)管中添加礦物油以避免溶液揮發(fā)。
1. 70℃孵育10 min，降至4℃后，將PCR反應(yīng)管從PCR儀取出，置于冰上，終止第一鏈cDNA合成。
2. 如果直接進(jìn)行PCR步驟，吸取1 μL或其整數(shù)倍的cDNA至一干凈、冰浴的200或500 μL PCR反應(yīng)管中作為模板進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)。如果您在第一鏈cDNA合成為避免揮發(fā)使用礦物油，在吸取溶液時(shí)應(yīng)小心避免吸入礦物油。如果第一鏈cDNA合成的產(chǎn)物不立即使用的話，應(yīng)該進(jìn)行每管3 μL cDNA的分裝，將分裝后的cDNA保存于-20℃。該產(chǎn)物可于-20℃保存1個(gè)月。
至此，您已獲得3'-和5'-RACE用的cDNA。擴(kuò)增您的目的基因只需少量cDNA即可，制備好的cDNA可用于多個(gè)基因的擴(kuò)增。如果您在完成3'-RACE和5'-RACE后，想用全長cDNA進(jìn)行長距離PCR（LD PCR）只需留存適量樣品進(jìn)行PCR即可。
IX.快速擴(kuò)增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)
5'-RACE和3'-RACE PCR反應(yīng)組分如表1所示。注意，全部的PCR反應(yīng)均經(jīng)過SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase優(yōu)化。
1. 制備PCR Mix時(shí)注意多制備1份以保證各體系的充足。5'-RACE和3'-RACE反應(yīng)試劑相同，各組分如下表所示：
表1 PCR反應(yīng)組分配制
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組分 |
5'-RACE 樣品 |
5AP 單引物 (– Control) |
3'-RACE 樣品 |
3AP 單引物 (– Control) |
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10× SUPERSWITCH? Hot Start Buffer |
2.5 μL |
2.5 μL |
2.5 μL |
2.5 μL |
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dNTP Mix (2.5mM) |
2~2.5 μL |
2~2.5 μL |
2~2.5 μL |
2~2.5 μL |
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GSP1（12 μM） |
0.1 μL |
／ |
／ |
／ |
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GSP2（12 μM） |
／ |
／ |
0.1 μL |
／ |
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5AP（12 μM） |
0.1μL |
0.2 μL |
／ |
／ |
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3AP（12 μM） |
／ |
／ |
0.1 μL |
0.2 μL |
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cDNA（試驗(yàn)樣） |
0.5 μL* |
0.5 μL* |
0.5 μL* |
0.5 μL* |
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SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase |
0.3~0.5 μL |
0.3~0.5 μL |
0.3~0.5 μL |
0.3~0.5 μL |
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PCR-Grade Water |
至25 μL |
至25 μL |
至25 μL |
*50 ng~0.5 μg
**GSP及接頭引物在12 μM的濃度下，25 μL PCR擴(kuò)增體系的添加體積注意不要超過0.2 μL。引物添加體積過大不僅容易形成非特異性擴(kuò)增，還容易造成擴(kuò)增產(chǎn)物的高背景。
2. 渦旋混勻（切勿產(chǎn)生氣泡），并瞬時(shí)離心。
3. 在200 μL或500 μL PCR反應(yīng)管中依序添加表1中的各組分，并混合均勻。
4. 每管中加2滴礦物油，并將管蓋蓋嚴(yán)。
注意：如用具有熱蓋功能的PCR儀可無需添加礦物油。
5. 使用下列程序啟動(dòng)PCR儀。根據(jù)cDNA的起始模板是mRNA或是總RNA選擇適宜循環(huán)數(shù)*。
注意：PCR設(shè)定的循環(huán)次數(shù)取決于目的基因的表達(dá)豐度，需要依據(jù)不同基因選擇適宜的PCR擴(kuò)增參數(shù)。以之前描述的體系、步驟先運(yùn)行30或35個(gè)循環(huán)后，在1.5%的EtBr膠中檢測(cè)PCR產(chǎn)物。如果條帶微弱或無帶，將裝有剩余產(chǎn)物的PCR管置于PCR儀上再運(yùn)行5個(gè)循環(huán)。最適延伸時(shí)間的設(shè)置依據(jù)所擴(kuò)增片段的長度。擴(kuò)增長度為2~4 kb時(shí)延伸時(shí)間為4 min，目的產(chǎn)物為0.2~2 kb時(shí)可將延伸時(shí)間降至2 min，5~10 kb的產(chǎn)物則增加至10 min。
程序（DNAman軟件melting temperature分析獲得的Hybridization Tm值50~70℃）:
? 35個(gè)循環(huán)（mRNA）:或
? 40個(gè)循環(huán)（總RNA）:
94℃ 30 sec
50~70℃（設(shè)定溫度梯度） 30 sec
72℃ 3 min*
*如果片段>3 kb，產(chǎn)物長度每增加1 kb延伸時(shí)間延長1 min。
6.[可選步驟]建議在50～68℃的溫度范圍內(nèi)選取6個(gè)溫度同時(shí)進(jìn)行溫度梯度擴(kuò)增，每25 μL PCR體系添加cDNA模板0.5 μL。如果初次的PCR反應(yīng)沒有得到清晰的目的條帶，或是泳道呈彌散狀，可以cDNA或是巢式引物作探針進(jìn)行Southern blot分析。或是以巢式引物進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)。
①在沒有明顯擴(kuò)增條帶的情況下，將6管不同溫度梯度下第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各吸取5~15 μL，進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收后，以相同體積的水洗脫，去除第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的引物及小于100 bp的短片段。第1次PCR產(chǎn)物直接或用水稀釋至1~100 倍后，利用巢式引物和接頭引物進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)。使用的引物為0.1 μL的SUPERSWITCH? 5AP/3AP和0.1 μL的NGSP，循環(huán)次數(shù)為30~33個(gè)。
②在有明顯條帶的情況下，將有條帶的第1次PCR產(chǎn)物各吸取5~10 μL（存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溫度兩側(cè)的產(chǎn)物也可以同時(shí)進(jìn)行回收），進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收后，以相同體積的水洗脫，去除第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的引物及小于100 bp的短片段。將第1次PCR產(chǎn)物直接或用水稀釋至1~100 倍后，利用巢式引物和接頭引物進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)。使用的引物為0.1 μL的SUPERSWITCH? 5AP/3AP和0.1 μL的NGSP，循環(huán)次數(shù)為30~33個(gè)。
X.RACE產(chǎn)物鑒定
本操作手冊(cè)推薦對(duì)RACE產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。這一操作可在已經(jīng)獲得全長cDNA，甚至得到單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物情況下進(jìn)行，進(jìn)行該操作的目的主要是為了避免浪費(fèi)您的試驗(yàn)時(shí)間。在RACE試驗(yàn)獲得多個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，或是懷疑擴(kuò)增的產(chǎn)物為多基因家族的情況下，進(jìn)行RACE產(chǎn)物鑒定的操作尤為重要。
產(chǎn)物鑒定的方法有3種可供選擇： ①比較以GSP和NGSP獲得的RACE產(chǎn)物； ②Southern blotting； ③克隆和測(cè)序。操作 ①和 ②需要NGSP以分析5'-RACE和3'-RACE產(chǎn)物。Southern blotting和克隆、測(cè)序等操作步驟可參見Sambrook & Russell（2001）或是其他適宜的操作手冊(cè)。
1.比較以GSPs和NGSPs獲得的RACE產(chǎn)物
5'-RACE反應(yīng)需要比較初次擴(kuò)增產(chǎn)物（SUPERSWITCH? 5AP和GSP1的擴(kuò)增產(chǎn)物）與二次擴(kuò)增產(chǎn)物（SUPERSWITCH? 5AP和NGSP1的擴(kuò)增產(chǎn)物），相應(yīng)的，3'-RACE反應(yīng)則需要比較初次擴(kuò)增產(chǎn)物（SUPERSWITCH? 3AP和GSP2的擴(kuò)增產(chǎn)物）與二次擴(kuò)增產(chǎn)物（SUPERSWITCH? 3AP和NGSP2的擴(kuò)增產(chǎn)物）。在初次PCR產(chǎn)物為多個(gè)條帶，或是非特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，進(jìn)行這一步驟有助于獲得正確的試驗(yàn)結(jié)果。如果條帶為目的條帶，在以巢式基因特異性引物進(jìn)行二次擴(kuò)增的時(shí)候，產(chǎn)物會(huì)變小，產(chǎn)物片段的差值應(yīng)與GSP和NGSP之間的距離一致。以SUPERSWITCH? 5AP和GSP1（或SUPERSWITCH? 3AP和GSP2）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)如果有多個(gè)條帶，在以SUPERSWITCH? 5AP和NGSP1（或SUPERSWITCH? 3AP和NGSP2）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)某些條帶可能會(huì)消失。
2.Southern Blotting分析
若以巢式的基因特異性引物作為探針（通常是其他的GSP或是NGSPs）進(jìn)行Southern blotting分析，可確定RACE產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。初次PCR產(chǎn)物得到多個(gè)條帶，或是用非特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Southern Blotting尤為重要。5'-RACE比3'- RACE更容易出現(xiàn)多個(gè)條帶。
①瓊脂糖/EtBr膠檢測(cè)RACE產(chǎn)物。
②拍照后，將DNA轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)的尼龍膜上。
③制備與GSP1（或GSP2） 序列不同的雜交探針，末端標(biāo)記的NGSP1（或NGSP2）也可用作探針。如果試驗(yàn)的GSP在5'和3'片段有重疊區(qū)的話，GSP2可用作檢測(cè)5'-RACE產(chǎn)物，GSP1可用作檢測(cè)3'-RACE產(chǎn)物。缺刻轉(zhuǎn)移或是之前克隆的部分cDNA的隨機(jī)引物內(nèi)部限制性酶切片段均可用作探針。
④Southern blotting與探針進(jìn)行雜交，在中等~高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行洗膜和曝光。
⑤將Southern blotting的雜交圖和電泳照片進(jìn)行比對(duì)。一般來講，傾向于分離Southern blotting膜中最大的RACE產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的條帶。如果凝膠電泳中存在某些更大的產(chǎn)物但并不能與基因特異性引物雜交，這些產(chǎn)物一般可以確定為非特異性擴(kuò)增。小于目的產(chǎn)物，且能與探針雜交的條帶可能是不完整的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但是也不能完全排除，這些短的條帶可能來源于正確的基因可變剪接產(chǎn)物，或來源于多個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄本，或是來源于多基因家族。
⑥一旦得到一條或數(shù)條目的條帶，需以膠回收試劑盒分離相應(yīng)的目的片段，繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。
3.RACE產(chǎn)物的克隆和測(cè)序
①對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠純化，并克隆至T/A克隆載體。
②對(duì)5'-RACE產(chǎn)物，我們推薦挑取8~10個(gè)不同的克隆以最大可能地獲取完整的5'末端。一旦獲得含有最長片段的克隆，即可進(jìn)行測(cè)序。理論上您可以獲取整個(gè)的開放閱讀框、5'和3'非翻譯區(qū)。
5'-RACE和3'-RACE反應(yīng)一般都可以進(jìn)行優(yōu)化，這種反應(yīng)體系的優(yōu)化也是試驗(yàn)所必需的。優(yōu)化的內(nèi)容包括提高目的片段的產(chǎn)量、減少非特異性擴(kuò)增的背景和/或不完整的RACE產(chǎn)物。本操作手冊(cè)推薦的cDNA合成方法制備的5'-RACE和3'-RACE用的cDNA足夠進(jìn)行100次以上的RACE PCR反應(yīng)，因此有充足的模板可用于優(yōu)化RACE擴(kuò)增。
1.第一鏈cDNA合成和SUPERSWITCH? PCR擴(kuò)增
如果目的產(chǎn)物較小（小于3 kb），產(chǎn)量較低，或無PCR產(chǎn)物須檢查以下步驟以確定反轉(zhuǎn)錄步驟的正確性。
SUPERSWITCH? 試劑盒中附帶的SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase等，均可實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄過程的模板跳轉(zhuǎn)。SUPERSWITCH? 技術(shù)所需的模板跳轉(zhuǎn)過程需要使用M-MuLV RNase H—點(diǎn)突變的反轉(zhuǎn)錄酶。SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase是一種遺傳修飾的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，該酶具有RNA和DNA依賴的聚合酶活性，但是缺乏RNase H活性（該活性區(qū)域點(diǎn)突變），不能降解第一鏈cDNA合成時(shí)形成的RNA-DNA復(fù)合物中的RNA，因而可獲得全長的cDNA。在42~55℃范圍內(nèi)SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase均有酶活性，因此適合逆轉(zhuǎn)錄具有較多二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA分子。
①RNA可能在貯存和（或）第一鏈合成的過程中發(fā)生降解。起始反應(yīng)物中低品質(zhì)的RNA將會(huì)降低全長cDNA合成的能力。RNA須于-70℃貯存。工作區(qū)域、設(shè)備及溶液中都不能含有RNase A。
②操作過程中可能使用了不適宜的孵育溫度或是遺漏了某一或某些重要組分。仔細(xì)檢查操作過程，并重復(fù)第一鏈cDNA合成和PCR反應(yīng)。
③需優(yōu)化PCR的條件及參數(shù)。不同的PCR儀、聚合酶或是RNA樣品應(yīng)該修正PCR的循環(huán)次數(shù)。如果PCR反應(yīng)的平臺(tái)期出現(xiàn)在24個(gè)循環(huán)或之后，說明PCR的反應(yīng)條件并非最佳，需進(jìn)行調(diào)整，并以新制備的0.5 μL（或其整數(shù)倍的）第一鏈產(chǎn)物重復(fù)PCR步驟。
④PCR產(chǎn)物量較低，或是得到的PCR產(chǎn)物較短。通常RNA樣品濃度較低或是降解時(shí)會(huì)出現(xiàn)這樣的結(jié)果，此外，樣品中含有抑制第一鏈cDNA合成的物質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象。如果樣品來源于非哺乳動(dòng)物，該物種可能的確會(huì)出現(xiàn)類似的PCR產(chǎn)物。如果RNA樣品來源于非哺乳動(dòng)物，顯然截短的PCR產(chǎn)物可能與該物種RNA正常大小的分布有關(guān)。以昆蟲為例，正常的RNA分布就是小于2~3 kb。因此有必要在甲醛變性膠中檢測(cè)試驗(yàn)樣品RNA的含量及完整性。
樣品中RNA含量較低，但品質(zhì)很好時(shí)，可以通過增加反轉(zhuǎn)錄過程中RNA模板的含量，或是增加PCR過程中的循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。
在合成第一鏈之前樣品就（因含有RNA酶）存在部分降解時(shí)，需重新制備RNA，并吸取一小部分在42℃孵育2 h，通過甲醛變性膠電泳比較樣品孵育前后的狀態(tài)。如果RNA在孵育過程中發(fā)生降解，也將影響第一鏈的cDNA合成。因而需要以其它方式重新分離RNA。多次的酚：氯仿抽提可以顯著增加RNA的穩(wěn)定性。
若樣品中含有抑制cDNA合成的成份，以80%的乙醇洗滌兩次可以除去某些水溶性成份，如果這一方法仍不奏效，需要以其它技術(shù)或RNA分離試劑盒提取RNA。
2.對(duì)照PCR反應(yīng)
SUPERSWITCH? 5AP/3AP單引物擴(kuò)增cDNA的陰性對(duì)照。小于35個(gè)循環(huán)時(shí)，應(yīng)該不出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。如果該對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物為彌散條帶或多個(gè)條帶形成的ladder，則需要重新修改循環(huán)參數(shù)。
3.PCR中一般會(huì)出現(xiàn)的問題
①富含GC的模板：如果PCR產(chǎn)物，尤其是5'-RACE產(chǎn)物，未出現(xiàn)目的條帶, 或是非預(yù)期條帶，可能是由于模板GC含量較高。試劑盒中提供的 SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase可用于擴(kuò)增富含GC的模板。但是PCR mix的體系和參數(shù)還需依據(jù)模板進(jìn)行修正。
②高保真PCR：若RACE產(chǎn)物還用于其他分析或研究，可以用高保真酶擴(kuò)增全長cDNA。
③降落PCR的問題：出現(xiàn)問題時(shí)應(yīng)首先修正程序最后設(shè)定的循環(huán)數(shù)（即68℃運(yùn)行的30~35個(gè)循環(huán)）。若電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)無擴(kuò)增產(chǎn)物，可將剩余產(chǎn)物重新置于PCR儀上再運(yùn)行5個(gè)循環(huán)。如果還沒有，可在68℃再運(yùn)行3~5個(gè)循環(huán)。若仍無產(chǎn)物，請(qǐng)重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將第3次循環(huán)的退火溫度降至68℃到65℃之間的某一溫度。如果GSP的Tm值接近70℃，上述程序的改進(jìn)會(huì)比較有效。
4.3'-RACE成功，但5'-RACE無擴(kuò)增產(chǎn)物。
這種情況常常是由于未能合成全長cDNA和/或未進(jìn)行模板跳轉(zhuǎn)反應(yīng)，應(yīng)重新合成第一鏈cDNA。
另外，合成的cDNA已經(jīng)降解。反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物未于-20℃凍存，或使用后未及時(shí)于-20℃凍存，或頻繁凍融cDNA都會(huì)出現(xiàn)這一情況。
5.RACE反應(yīng)中都未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR（尤其是5'- RACE和3'-RACE）的30~35個(gè)循環(huán)之后還未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶，將剩余產(chǎn)物重新置于PCR儀上再運(yùn)行5個(gè)循環(huán)。需要根據(jù)不同的PCR儀優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及參數(shù)。如果這些方法都不奏效，則可能是由于cDNA合成和/或模板跳轉(zhuǎn)反應(yīng)失敗造成的，需要重新合成第一鏈cDNA。
6.樣品制備的第一鏈cDNA，5'-或3'-RACE均無目的條帶。
需要首先確認(rèn)目的基因是否表達(dá)！
如目的基因在您使用的RNA中表達(dá)豐度并不高時(shí)，可在原PCR循環(huán)數(shù)上再多運(yùn)行5個(gè)循環(huán)，直至RACE產(chǎn)物出現(xiàn)，但是降落PCR的循環(huán)數(shù)不要超過50個(gè)，非降落PCR的循環(huán)數(shù)不要超過41個(gè)。若仍無目的條帶，需要在目的基因表達(dá)豐度較高的樣品中重復(fù)試驗(yàn)。
設(shè)計(jì)的基因特異性引物的退火溫度低于68℃，可以進(jìn)行50~70℃之間的溫度梯度試驗(yàn)。
設(shè)計(jì)的基因特異性引物不適用于該P(yáng)CR體系。以第Ⅵ部分引物設(shè)計(jì)的原則檢查引物的設(shè)計(jì)是否合理，并視需要重新設(shè)計(jì)引物。
由于目的基因富含二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或富含GC，難于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在靠近c(diǎn)DNA末端的位置重新設(shè)計(jì)引物。如已知某區(qū)域富含GC，避免在該區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
目的基因太長，不能完全反轉(zhuǎn)和/或進(jìn)行長距離PCR。盡可能在靠近c(diǎn)DNA末端的位置設(shè)計(jì)引物，并重新以基因特異性引物或是6核苷酸的隨機(jī)引物代替試劑盒中的SUPERSWITCH? 3RRT1重新合成第一鏈cDNA。
從總RNA中純化出mRNA后，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，可大大提高基因5' -RACE的成功率。
7.RACE產(chǎn)物含有多個(gè)條帶。
某些情況下，試驗(yàn)樣品會(huì)產(chǎn)生多個(gè)5'-RACE和/或3'-RACE產(chǎn)物。如上文所述，這種情況下，需要判定哪一（或哪些）條帶為目的片段，哪些為假陽性片段，確定目的片段和全長片段需要確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)、多腺苷酸化位點(diǎn)和基因組測(cè)序等研究工作，利用下面的方法有助于剔除假陽性片段。
多條產(chǎn)物并不表示不能得到全長cDNA。若能剔除非特異性條帶，最終也能節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間。通常以每次RACE產(chǎn)物中的得到的最長的片段進(jìn)行下面的試驗(yàn)就能獲得真正的、完整的RACE產(chǎn)物。
①“陽性”多條RACE產(chǎn)物的來源
個(gè)別基因由于存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本會(huì)形成多個(gè)RACE片段，機(jī)制通常分為以下3類： mRNA的可變剪接可形成多個(gè)5'-或3'- RACE產(chǎn)物；不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可形成多個(gè)5'-RACE產(chǎn)物；不同的多聚腺苷酸化位點(diǎn)可形成多個(gè)3'-RACE產(chǎn)物。
另一方面，目的基因可能是多基因家族的成員之一，由于基因家族間序列的相似性，設(shè)計(jì)的基因特異性引物可在多個(gè)基因間進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
區(qū)分真正的序列不同的RNA屬于科學(xué)研究的范疇，但是，通過本試劑盒能發(fā)現(xiàn)某一來源的RNA表達(dá)豐度要高于其他來源的RNA。
②假陽性產(chǎn)物的來源
多條擴(kuò)增產(chǎn)物通常并不實(shí)際對(duì)應(yīng)真實(shí)、完整的轉(zhuǎn)錄本。這些假陽性的RACE產(chǎn)物可分為兩類，即不完整的RACE產(chǎn)物和非特異性的RACE產(chǎn)物。
正確的引物結(jié)合位點(diǎn)的不完整擴(kuò)增片段可能是以下幾個(gè)原因造成的：因反轉(zhuǎn)錄中止而產(chǎn)生的不完整的第一鏈cDNA通常會(huì)形成多條的5'-RACE產(chǎn)物。在RNA分子較大時(shí)這種現(xiàn)象尤為普遍，但也較為難以解決，因?yàn)檫@一現(xiàn)象是由反轉(zhuǎn)錄過程的內(nèi)在缺陷決定的，很難克服；以降解的RNA起始第一鏈cDNA的合成通常會(huì)形成多條的5'-RACE產(chǎn)物；某一特定基因因模板的高GC含量使PCR擴(kuò)增過程十分困難，也會(huì)導(dǎo)致形成多條5'-或3'-RACE產(chǎn)物；非特異性RACE產(chǎn)物則來源于引物與雙鏈cDNA的多個(gè)非特異性的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，或是由引物二聚體造成的假陽性。
③建議：
注意一定要進(jìn)行推薦的對(duì)照PCR擴(kuò)增，并且GSP的單引物擴(kuò)增不應(yīng)有條帶，而與接頭引物結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)應(yīng)只有單一條帶。若GSP的單引物擴(kuò)增有條帶的話，應(yīng)修改循環(huán)參數(shù)或設(shè)計(jì)NGSP；使用5 μL 5~10倍稀釋的RACE-Ready cDNA重復(fù)PCR擴(kuò)增；檢測(cè)用于第一鏈cDNA合成的RNA（見第Ⅶ部分）。如果RNA分子量低于理論值，重新進(jìn)行RNA提取和cDNA合成的步驟。
采用以上操作后，如果仍有多個(gè)條帶，依據(jù)以下方式改進(jìn)PCR循環(huán)參數(shù)：以2~5℃為一個(gè)單位升高PCR的退火溫度，以增加PCR的嚴(yán)謹(jǐn)性。一般非特異性擴(kuò)增的條帶會(huì)消失，只保留正確或不完整的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物；減少循環(huán)次數(shù)；減少延伸時(shí)間；RACE產(chǎn)物較大的情況下，增加延伸時(shí)間也能消除多余的條帶。
如果經(jīng)過上述處理還有多個(gè)條帶，依據(jù)以下方式設(shè)計(jì)新的一組PCR引物：最好設(shè)計(jì)巢式的基因特異性PCR引物，其產(chǎn)物大小有一定差別。這兩條基因特異性引物既可以單獨(dú)與接頭引物組合后使用，也可以第1次PCR的產(chǎn)物做為模板進(jìn)行巢式PCR。與任一基因特異性引物擴(kuò)增相比，巢式PCR通常會(huì)降低PCR反應(yīng)的背景和非特異性擴(kuò)增，巢式引物的設(shè)計(jì)請(qǐng)參見第Ⅵ部分。
與巢式PCR相比，我們首先推薦進(jìn)行GSP1/NGSP1與5AP的PCR擴(kuò)增。這兩次PCR的結(jié)果有助于顯示多個(gè)條帶是特異性還是非特異性的。特異性條帶在兩次擴(kuò)增中都會(huì)出現(xiàn)，但是巢式的基因特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物要小一些。兩次擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)之差與引物設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)應(yīng)的cDNA距離一致。如果上述的各種方法均不能得到特異性的結(jié)果，應(yīng)以基因特異性引物和隨機(jī)引物代替本試劑盒提供的SUPERSWITCH? 3RRT1/ 3RRT2重新合成cDNA。
8.RACE cDNA產(chǎn)物為彌散條帶。
某些RACE產(chǎn)物的條帶非常復(fù)雜，呈彌散狀。大多，尤其是3'-RACE反應(yīng)呈彌散狀，是由于RACE反應(yīng)前的問題造成的。5'-RACE的彌散條帶通常是因反轉(zhuǎn)錄的模板或是RNA存在降解造成的。
合成第一鏈cDNA的RNA中存在污染或是反轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)問題都會(huì)造成擴(kuò)增條帶出現(xiàn)彌散。無論是哪種情況，都應(yīng)當(dāng)重新提取RNA后再進(jìn)行RACE工作（或是確認(rèn)用于第一鏈合成的RNA不存在污染）。
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