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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

親脂性熒光染料PKH67(Green)和PKH26(Red) 適用于常規(guī)細胞膜標記。PKH26熒光細胞連接試劑盒采用采用膜標記技術，能夠將帶有較長脂質尾巴的黃色-橙色熒光染料結合到細胞膜脂質區(qū)域上。染色方式依賴于細胞與膜的類型，主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究及體內外細胞示蹤研究。試劑盒中提供染色過程中所需的溶劑（稀釋液C），該溶劑可以可以在染色過程中，增加染料溶解度和染色效率，同時維持細胞活力。稀釋液C與哺乳動物細胞等滲，且不含去垢劑或有機溶劑，也不含生理鹽水和緩沖鹽。根據(jù)細胞類型及標記后細胞膜內在的變化，標記后的細胞表面會由均一透亮變得有點狀凸起或補丁狀。但在生理范圍內，PKH26熒光不受pH的影響，每個細胞的熒光強度與染料標記位置無關。

PKH26熒光在黃色-橙色區(qū)域（λex=551 nm,  λem=567 nm），可用來標記追蹤體內外多種細胞。在細胞毒性分析，熒光蛋白、抗體或DNA染料在該區(qū)域發(fā)出的紫色、綠色、紅色和遠紅外等，不會與PKH26產(chǎn)生干擾。PKH26最常被用于基于染料稀釋增殖的分析的染料稀釋應用，包括建立抗原特異性前體頻譜和正?；蚰[瘤組織中靜止或緩慢干細胞或祖細胞的鑒定。同時PKH26也可用于監(jiān)測外來病毒、血小板和其他納米顆粒的攝入；干細胞分裂過程中膜的分配；細胞-細胞之間膜的轉移；細胞吞噬作用；抗原呈遞；粘附；通過間隙連接的信號傳遞；以及組織切片中的神經(jīng)元遷移。PKH26熒光穩(wěn)定性很強，特別是標記的細胞的研究周期超過一周時PKH26被用于體內細胞追蹤研究。

試劑盒組分

實驗步驟

1.  一般細胞膜標記

親脂性染料結合到細胞膜上完成標記。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數(shù)，與滲透性無關。因此，保證染料添加量不過量非常關鍵。過標記的細胞將會導致細胞膜完整性缺失和或降低細胞活性。

下列過程可用于體內體外細胞的標記，包括干細胞、淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞、神經(jīng)細胞或者任何其他細胞。體內細胞的標記過程需一定的改進，如血小板的染色，或者選擇性標記吞噬細胞。

下述染色過程中細胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細胞。使用者需通過評估染色后細胞活率（如，PI染色）、熒光強度、染色均勻度及是否對所研究細胞功能有影響等，根據(jù)實驗目的，確定最優(yōu)的染料濃度和細胞濃度。

無菌操作示范步驟（總體積2ml，染色終濃度為2×10-6M PKH26染料和1×107細胞/ml，所有操作在20～25℃）

1. 胰酶和/或EDTA消化細胞形成單細胞懸液，將2×107個細胞于錐形離心管中，用無血清培養(yǎng)基洗一次。注意：血清蛋白和脂質會與染料結合，降低與細胞膜結合的染料濃度。最好在用稀釋液C重懸細胞染色前（第四步）用無血清培養(yǎng)基或緩沖液洗細胞一次（第一步）。

2. 400×g離心5分鐘形成松散的細胞團。注意：PKH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。

3. 離心后，小心吸棄上層清液，細胞團上剩余液體<25ul。注意：為得到可重復的實驗結果，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積。

4. 加入1mL稀釋液C，用移液管輕輕吹打混勻，制備2×細胞懸液。重懸細胞保證完全離散，別震蕩，不要讓細胞在稀釋液C中保存太長時間。

注意：生理鹽的存在會使得染料結團并大幅降低染色效率。需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中，不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。

5. 臨染色之前，將4μL PKH26乙醇溶液加入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的2×染色液（4×10-6M）。

注意1：為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。

注意2：如果所需染料最終濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨的容器中，以確保實驗結果的可重復性。

6. 快速將1mL 2×細胞懸液（步驟4）加入1mL 2×染色液（步驟5）中，立即用吸管均勻快速混合樣品，因為均勻的染色是在瞬間發(fā)生的。（最終細胞濃度為1×107/mL，PKH26濃度為2×10-6M）。

注意：由于染色瞬間完成，快速將細胞與染料混勻對得到明亮、均勻和可重復的標記結果非常重要。為獲得最佳效果應采取下述措施：

  a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中。

  b. 將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。

  c. 調整2×細胞和2×染料的濃度避免染色體積太?。ǎ?span>100μL）或太大（＞5mL）。

  d. 用電動移液器快速將細胞和染料混勻。血清移液管混勻速度太慢而使得染色不均勻。震蕩和旋渦震蕩混勻同樣混勻較慢，染色均一性差。

  e. 分配體積盡量準確，以保證樣品與樣品之間，實驗與實驗之間的可重復性。

7. 混勻后的染色的細胞25℃孵育的2-5min，定時輕輕顛倒離心管保證在25℃充分混勻。由于染色速度較快，延長孵育時間對實驗沒有幫助。

注意：讓細胞在染色液中停留盡量短的時間，同時保證得到理想的染色強度。因為稀釋液C缺少生理性鹽，過長時間的暴露在稀釋液C中會造成某些細胞活力降低。如果不能確定其影響程度，可增加僅作稀釋的對照組和只用乙醇而不用染料染色的對照組。

8. 加入等體積的血清（2mL）或加入等量血清或1%BSA中止染色反應，孵育1min以結合多余的染料。

注意1：血清（或等效的蛋白濃度）為最優(yōu)的終止液。如果用完全培養(yǎng)基（含血清的組織培養(yǎng)基）替代，添加體積為10mL。

注意2：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應。

注意3：不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽，他們會使染料產(chǎn)生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標記的細胞。

9. 將細胞在20-25℃條件下400×g離心10 min，小心吸棄上清。用10mL完全培養(yǎng)基（含血清的組織培養(yǎng)基）重懸，將重懸液轉移至另一新的無菌離心管中，20-25℃條件下400×g離心5 min。用10mL完全培養(yǎng)基再清洗兩遍以除去沒結合的染料。

注意1：將重懸液轉移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響；注意2：不要用稀釋液C清洗。

10. 最后一步清洗后，用10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒光強度。離心重懸細胞至所需活細胞濃度。

注意1：染色后的細胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強度至少3周內保持穩(wěn)定。

注意2：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍。雖然染色的CV值與細胞種類有關，但熒光分布應該盡量均勻對稱。

11. 熒光顯微鏡/流式細胞儀分析細胞。檢查細胞復蘇情況、傳代情況及熒光濃度。染色應均勻，比本底熒光高100-1000倍。

1.  組織學：

制備和保存含PKH標記細胞切片時要冰凍切片和特殊的封固標本技術。

切片制備：

1、 切除組織后立即放入干冰冰凍。

2、 切片前-70℃保存。

3、 用OCT（Tissue-Tek; Miles, INC.）復合物制作冰凍切片。

4、 4-5um組織切片。

5、 載玻片室溫下干燥1h。

6、 封固蓋玻片用1-2滴氰基丙烯酸鹽粘合劑酯膠。

7、 檢查和拍片時用標準的濾光器如FITC(PKH2和PKH67)或TRITC（PKH26）。

復染切片：

1、 將玻片浸在丙酮液24-48h，去除蓋片；

2、 蒸餾水清洗去丙酮；

3、 復染切片易用Mayer或Harris蘇木精；

4、 封固載玻片用AS/AP永久性水合封固液（Bio/Can America, Inc.，Porland, ME）

注意：由于有機溶劑可析取PKH染液，而復染又吸收熒光，因而同時觀察組織學和PKH熒光不可取。

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