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產(chǎn)品簡介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細(xì)胞膜滲透性的活細(xì)胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團(tuán)的存在不僅加強(qiáng)疏水性，使其能輕易穿透活細(xì)胞膜。而且封閉結(jié)合鈣離子的分子部分，本身不發(fā)熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。因不具有細(xì)胞膜滲透性，從而被保留在胞內(nèi)。與其它活細(xì)胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細(xì)胞染色探針，因細(xì)胞毒性很低，而且不會抑制任何細(xì)胞功能如增殖或淋巴細(xì)胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分可信，與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放法所得結(jié)果一致。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這一特征使其非常適合用來檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，因其僅能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域到達(dá)細(xì)胞核，嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋區(qū)域，并產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。結(jié)合這些特點(diǎn)，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用作活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

本試劑盒就是結(jié)合Calcein-AM和PI的雙重染料，來進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)試劑盒優(yōu)化體系，單次以200μl細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，可做500次檢測。

試劑盒組分

S3512-500T   

S3512-A  Calcein AM Solution(4 mM)   -20oC避光     50μl 

S3512-B  PI Solution（1.5 mM）   -20oC避光     200μl     

S3512-C  10×Assay Buffer     -20oC~4℃     50ml    

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃避光保存，有效期一年。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、試劑準(zhǔn)備

1.1 1×反應(yīng)緩沖液（Assay Buffer）的配制

從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2 1×染色工作液（Stain Buffer）的配制

1） 先將低溫保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室溫回溫至少20min，使其充分融化?！咀⒁猓旱谝淮问褂脮r建議對儲存液根據(jù)單次用量分裝，特別是Calcein AM，以減少反復(fù)凍融次數(shù)?！?span>

2） 取5μl Calcein AM溶液 (4 mM)和15μl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein AM的工作液濃度為4μM，PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果。【注意：染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完?！?span>

二、染色步驟

2.1 對于貼壁細(xì)胞，先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。

對于懸浮細(xì)胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細(xì)胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer制備細(xì)胞懸液，使其密度為1×105~1×106細(xì)胞/ml。

2.4 取100μl染色工作液加入200μl細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延長孵育時間至30min?！?span>

2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時檢測活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測。

【注意】：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細(xì)胞10min，或者用70%乙醇孵育細(xì)胞30min，從而制備死細(xì)胞；

b) 用0.1-10μM的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對細(xì)胞核染色，而不會對細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。

c) 用0.1-10μM的Calcein AM進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會對細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。

測定方法與結(jié)果呈現(xiàn)

1） 熒光顯微鏡（Fluorescent Microscopy）

檢測方法：490±10 nm激發(fā)能同時看到呈黃-綠色熒光的活細(xì)胞和紅色的死細(xì)胞。另，545nm激發(fā)可能只能看到呈紅色的死細(xì)胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2） 熒光酶標(biāo)儀（Fluorescent Plate Reader）

檢測方法：96孔透明底的黑色酶標(biāo)板（96-well black plate with clear bottom），Calcein檢測的激發(fā)波長為490nm，發(fā)射波長為520nm；PI檢測的激發(fā)波長為530nm，發(fā)射波長為617nm；

3） 流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）

檢測方法：流式細(xì)胞儀，Calcein檢測的激發(fā)/發(fā)射波長為488/535nm，PI的激發(fā)和發(fā)射波長為488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常見問題

1、 該試劑盒適用任何細(xì)胞類型？

基本上適用于任何含酯酶活性的動物細(xì)胞。植物和細(xì)菌細(xì)胞因含有細(xì)胞壁，Calcein-AM不能進(jìn)入因此無法染色。有可能對原生質(zhì)體進(jìn)行染色。

2、 用相同濃度有可能對所有哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行染色？

對所有細(xì)胞都用相同的濃度是很不合理的。Calcein-AM和PI的最佳工作濃度根據(jù)細(xì)胞類型差異很大。有必要根據(jù)具體細(xì)胞來確定最佳染料濃度。參考說明書染料工作濃度優(yōu)化方法。

3、 Calcein-AM對細(xì)胞有毒？

與其他相似的活細(xì)胞染料比較，Calcein-AM基本無毒（毒性最?。?。見文獻(xiàn)EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

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